10.3 Utilização de sondas moleculares para encontrar e analisar um clone de interesse específico

10.3 Utilização de sondas moleculares para

encontrar e analisar um clone de interesse

específico

A produção de uma biblioteca conforme acabamos de descrever por vezes é denominada clonagem shotgun, tendo em vista que o experimentador clona uma grande amostra de fragmentos e espera que um dos clones contenha um “acerto” — o gene desejado. A tarefa em seguida é encontrar aquele clone em particular, considerada em seguida.

Detecção de clones específicos com a utilização de sondas Uma biblioteca pode conter até centenas de milhares de fragmentos de DNA clonados. Essa enorme coleção de fragmentos deve ser triada para encontrar a molécula de DNA recombinante que contém o gene de interesse para um pesquisador. A referida triagem é realizada por meio da utilização de uma sonda específica, que encontrará e marcará apenas o clone desejado. Existem dois tipos de sondas: (1) aquelas que reconhecem uma sequência de ácido nucleico específica e (2) aquelas que reconhecem uma proteína específica.

Sondas para detectar DNA. As sondas para DNA fazem uso do poder da complementaridade de bases. Dois ácidos nucleicos unifilamentares com sequência de bases complementares total ou parcial “encontrarão” um ao outro em uma solução por colisão aleatória. Após a sua união, o híbrido bifilamentar assim formado é estável. Essa abordagem proporciona um meio poderoso para a detecção de sequências de interesse específicas. O uso de sondas de DNA requer que todas as moléculas se tornem unifilamentares por meio de aquecimento. Uma sonda unifilamentar marcada radioativa ou quimicamente é enviada para detectar sua sequência-alvo complementar em uma população de DNA tal como uma biblioteca. Sondas tão pequenas quanto de 15 a 20 pares de bases hibridizarão com as sequências complementares específicas dentro de DNA clonados muito maiores.

A identificação de um clone específico em uma biblioteca é um

procedimento de múltiplas etapas. Na Figura 10.12, essas etapas estão demonstradas em relação a uma biblioteca clonada em um vetor fosmídio. As etapas são semelhantes para bibliotecas de plasmídios ou BAC. Em relação às bibliotecas de fagos, placas são triadas em vez de colônias. Primeiramente, colônias da biblioteca em uma placa de Petri são transferidas para uma membrana absorvente simplesmente posicionando-se a membrana sobre a superfície do meio. A membrana é retirada, as colônias aderidas à superfície da membrana são lisadas no local e o DNA é simultaneamente desnaturado, de modo a se tornar unifilamentar. Em segundo lugar, a membrana é banhada com uma solução de uma sonda unifilamentar que é específica para a sequência de DNA que está sendo procurada. Em geral, a própria sonda é um fragmento de DNA clonado, que apresenta uma sequência que é complementar àquela do gene desejado. A sonda deve ser marcada com um isótopo radioativo ou um corante fluorescente. Portanto, a posição de uma marcação radioativa ou fluorescente concentrada indicará a posição do clone positivo. Em relação às sondas radioativas, a membrana é posicionada sobre um pedaço de filme de raios X e o decaimento do radioisótopo produz partículas subatômicas que “expõem” o filme, produzindo nele um ponto escuro adjacente à localização da concentração do radioisótopo. Um referido filme exposto é denominado autorradiograma. Se um corante fluorescente for utilizado como um marcador, a membrana é exposta ao comprimento de onda de luz correto para ativar a fluorescência do corante, e é realizada uma fotografia da membrana para registrar a localização do corante fluorescente.

FIGURA 10.12 O clone que carrega um gene de interesse é identificado por meio da triagem de uma biblioteca genômica, neste caso produzida por meio da clonagem de genes em um vetor fosmídio, com DNA ou RNA sabidamente relacionado com o gene desejado. Uma sonda radioativa hibridiza com qualquer DNA recombinante que incorpore uma sequência de DNA complementar, e a posição do clone que apresenta o DNA é revelada por meio de autorradiografia. Agora o clone desejado pode ser selecionado a partir do ponto correspondente na placa de Petri e transferido para um novo hospedeiro bacteriano, de modo que um gene puro possa ser produzido.

Qual a origem do DNA para produzir uma sonda? O DNA pode ter

origem em uma de diversas fontes.

• Pode-se utilizar um gene homólogo ou um cDNA de um organismo

correlato. Esse método depende do fato de que organismos descendentes

de um ancestral comum recente apresentarão sequências de DNA

semelhantes. Embora o DNA da sonda e o DNA do clone desejado

possam não ser idênticos, com frequência eles são semelhantes o

suficiente para promover a hibridização.

• Pode-se utilizar o produto proteico do gene de interesse. Se toda a

sequência da proteína, ou parte dela, for conhecida, pode-se retrotraduzi-

la, por meio da utilização da tabela do código genético ao contrário (de

aminoácido para códon), para deduzir as sequências de DNA que podem

tê-la codificado. Em seguida, é projetada uma sonda de DNA sintética

que corresponde àquela sequência. Relembre, entretanto, que o código

genético é degenerado — ou seja, a maior parte dos aminoácidos é

codificada por múltiplos códons. Portanto, teoricamente, diversas

possíveis sequências de DNA podem codificar a proteína em questão,

mas apenas uma dessas sequências de DNA está presente no gene que de

fato codifica a proteína. Para contornar esse problema, é selecionado um

trecho curto de aminoácidos com redundância mínima. Um conjunto

misto de sondas é projetado em seguida, contendo todas as possíveis

sequências de DNA que podem codificar essa sequência de aminoácidos.

Esse “coquetel” de oligonucleotídios é utilizado como uma sonda, e um

filamento correto ou muito semelhante nesse coquetel hibridizará com o

gene de interesse. Oligonucleotídios de aproximadamente 20 nucleotídios

de comprimento têm especificidade suficiente para hibridizar com uma

única sequência de DNA complementar na biblioteca.

Sondas para a detecção de proteínas. Se o produto proteico de um gene for conhecido e isolado na forma pura, essa proteína então poderá ser utilizada para detectar o clone do gene correspondente em uma biblioteca. O

processo, descrito na Figura 10.13, requer dois componentes. Primeiramente, ele requer uma biblioteca de expressão, produzida por meio da utilização de vetores de expressão que direcionarão a célula hospedeira para produzir a proteína. Para construir a biblioteca, o cDNA é inserido no vetor na trinca correta do quadro de leitura com um promotor bacteriano e as células que contêm o vetor e seu inserto produzem uma tradução do inserto de cDNA. Em segundo lugar, o processo necessita de um anticorpo que se ligue ao produto proteico específico do gene de interesse. (Um anticorpo é uma proteína produzida pelo sistema imune de um animal que se liga com alta afinidade a uma determinada molécula.) O anticorpo é utilizado para triar a biblioteca de expressão daquela proteína. Uma membrana é sobreposta na superfície do meio e removida de modo que algumas das células de cada colônia agora estejam aderidas à membrana em locais que correspondem às suas posições sobre a placa de Petri original

(ver Figura 10.13). A membrana impressa em seguida é seca e banhada em uma solução do anticorpo, que se ligará à impressão de qualquer colônia que contenha a proteína de fusão de interesse. Clones positivos são revelados por meio de um anticorpo secundário marcado que se liga ao primeiro anticorpo. Ao detectar a proteína correta, o anticorpo identifica o clone que contém o gene que deve ter sintetizado aquela proteína e que, portanto, contém o cDNA desejado.

FIGURA 10.13 Para encontrar o clone de interesse, uma biblioteca de expressão construída com o vetor de fago λ especial denominado λgt11 é triada com um anticorpo específico de proteína. Após os anticorpos não ligados à membrana terem sido removidos, os anticorpos ligados são visualizados por meio da ligação de um anticorpo secundário radioativo.

Podemos observar como esse tipo de sonda atua na prática ao retornar ao

exemplo da insulina humana. Para clonar um cDNA correspondente à insulina humana, primeiramente sintetizamos cDNA com a utilização de mRNA isolado de células pancreáticas como o molde. Em seguida as moléculas de cDNA são inseridas em um vetor bacteriano de expressão e o vetor é transformado dentro de bactérias. As colônias bacterianas que contiverem o cDNA de insulina expressarão a proteína insulina. A proteína insulina é identificada por meio de sua ligação com um anticorpo de insulina, conforme descrito anteriormente.