Introdução à Genética
10.4 Determinação da sequência de bases de um segmento de DNA
10.4 Determinação da sequência de bases de
um segmento de DNA
Após termos clonado e identificado nosso gene desejado ou termos amplificado esse gene por meio da PCR, tem início a tarefa de tentar compreender a sua função. A linguagem final do genoma é composta por filamentos dos nucleotídios A, T, C e G. A obtenção da sequência de nucleotídios completa de um segmento de DNA com frequência é uma parte importante da compreensão da organização de um gene e da sua regulação, sua relação com outros genes ou da função do RNA ou da proteína que ele codifica. De fato, a sequência de DNA pode ser utilizada para determinar a estrutura primária proteica, tendo em vista que, na maior parte, a tradução da sequência de ácidos nucleicos de uma molécula de cDNA para descobrir a sequência de aminoácidos de sua cadeia polipeptídica codificada é mais simples do que sequenciar diretamente o próprio polipeptídio. Nessa seção, consideramos as técnicas utilizadas para ler a sequência de nucleotídios do DNA.
Assim como as tecnologias do DNA recombinante e da PCR, o
sequenciamento do DNA explora a complementaridade de pares de bases juntamente com uma compreensão da bioquímica básica da replicação do DNA. Foram desenvolvidas diversas técnicas, mas uma delas tem sido o método predominante utilizado até agora para sequenciar a maior parte das moléculas de DNA. Embora ainda seja a técnica mais comumente utilizada para sequenciar DNA mais curtos, novas tecnologias de sequenciamento suplantaram amplamente essa técnica quando o objetivo é determinar a
sequências de genomas inteiros, conforme descrito em detalhes no Capítulo
14.
Essa técnica de sequenciamento é denominada sequenciamento didesóxi
ou, por vezes, sequenciamento de Sanger, em homenagem ao seu inventor. O termo didesóxi tem origem em um nucleotídio especial modificado, denominado didesoxinucleotídio trifosfato (genericamente, ddNTP). Esse nucleotídio modificado é a chave para a técnica de Sanger, em virtude da sua capacidade de bloquear a síntese contínua do DNA. Um didesoxinucleotídio não apresenta o grupo 3′-hidroxila, bem como o grupo
2′-hidroxila, que também está ausente em um desoxinucleotídio (Figura
10.16; compare com a Figura 7.5). Para que a síntese do DNA ocorra, a DNA polimerase deve catalisar uma reação entre o grupo 3′-hidroxila do último nucleotídio e o grupo 5′-fosfato do próximo nucleotídio a ser adicionado. Tendo em vista que um didesoxinucleotídio não apresenta o grupo 3′-hidroxila, essa reação não pode ocorrer e, portanto, a síntese do DNA é bloqueada no ponto da adição.
A lógica do sequenciamento didesóxi é direta. Suponha que desejamos
ler a sequência de um segmento de DNA clonado de até 800 pares de bases. Esse segmento de DNA pode ser um inserto de plasmídio ou até mesmo um produto da PCR. Primeiramente, desnaturamos os dois filamentos desse segmento. Em seguida, criamos um primer para a síntese de DNA que hibridizará exatamente em um local no segmento de DNA clonado e, em seguida, adicionamos um “coquetel” especial de DNA polimerase, desoxinucleotídios trifosfato normais (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e uma pequena quantidade de um didesoxinucleotídio a uma das quatro bases (p. ex., ddATP). A polimerase começará a sintetizar o filamento de DNA complementar, iniciando a partir do primer, mas será interrompida em qualquer ponto no qual o didesoxinucleotídio trifosfato for incorporado na cadeia de DNA em crescimento em lugar do desoxinucleotídio trifosfato normal. Suponha que o segmento de DNA que estamos tentando sequenciar seja
5′ ACGGGATAGCTAATTGTTTACCGCCGGAGCCA 3′
FIGURA 10.16 2′,3′-didesoxinucleotídios, que são empregados no método de sequenciamento de DNA de Sanger, estão ausentes no grupo hidroxila da ribose presente no DNA.
Em seguida, iniciaremos a síntese de DNA a partir de um primer complementar:
Utilizando o coquetel especial para a síntese de DNA “enriquecido” com uma pequena quantidade de ddATP, por exemplo, criaremos um conjunto estabelecido de fragmentos de DNA que apresentam o mesmo ponto de início, mas diferentes pontos de término, tendo em vista que os fragmentos são interrompidos no ponto de inserção de ddATP, em vez de dATP, interrompendo a replicação do DNA. A série de diferentes cadeias de DNA interrompidas por ddATP se assemelha à lista de sequências a seguir. (*A indica o didesoxinucleotídio.)
Podemos produzir um arranjo dos referidos fragmentos para cada um dos
quatro didesoxinucleotídios trifosfato possíveis em quatro coquetéis em separado (um enriquecido com ddATP, um com ddCTP, um com ddGTP e um com ddTTP). Cada um produzirá um arranjo diferente de fragmentos, com nenhum de dois coquetéis enriquecidos produzindo fragmentos do mesmo tamanho. Em seguida, os fragmentos de DNA gerados nos quatro coquetéis são separados e colocados em ordem com a utilização de eletroforese em gel. Ao aplicar os fragmentos em quatro colunas adjacentes de um gel de poliacrilamida que pode separar fragmentos de DNA que variam em apenas um nucleotídio no comprimento, observamos que os fragmentos podem ser ordenados pelo comprimento, com os comprimentos aumentando em uma base por vez.
Os filamentos recém-sintetizados devem ser marcados de algum modo
para tornar as bandas visíveis no gel. Os filamentos são marcados na medida em que são produzidos por meio da utilização de um primer marcado radioativamente ou quando houver um dos dNTP regulares com marcação radioativa. Também podem ser utilizadas marcações fluorescentes e, nesse caso, a fluorescência ocorre em cada ddNTP (ver a seguir).
Os produtos das referidas reações de sequenciamento didesóxi estão
demonstrados na Figura 10.17. Tal resultado é uma escada de cadeias de DNA marcadas que aumentam em comprimento uma a uma e, assim, tudo o que precisamos fazer é ler o gel para ler a sequência de DNA do filamento sintetizado no sentido de 5′ para 3′.
Se a marcação for um corante fluorescente, um emissor de cor
fluorescente diferente é utilizado para cada uma das quatro reações de ddNTP e um detector na extremidade do gel consegue distinguir cada uma das cores. As quatro reações ocorrem no mesmo tubo de ensaio, e os quatro conjuntos de cadeias de DNA formadas podem ser submetidos à eletroforese juntos. Portanto, quatro vezes mais sequências podem ser produzidas no mesmo período de tempo do que as que seriam produzidas por meio de reações em separado. Essa lógica é utilizada na detecção da fluorescência por máquinas de sequenciamento automático de DNA. Graças a essas máquinas, o sequenciamento de DNA pode prosseguir em um nível maciço e sequências de genomas inteiros foram obtidas por meio da
ampliação dos procedimentos descritos nesta seção. A Figura 10.18 ilustra uma leitura de sequenciamento automático. Cada pico colorido representa um fragmento de DNA de tamanho diferente, que termina com uma base fluorescente detectada pelo scanner fluorescente do sequenciador automático de DNA; as quatro cores diferentes representam as quatro bases do DNA. As aplicações da tecnologia de sequenciamento automático em
escala genômica são um foco importante do Capítulo 14.
FIGURA 10.17 O DNA é sequenciado com eficiência por meio da inclusão de didesoxinucleotídios entre os nucleotídios utilizados para copiar um segmento de DNA. A. Um primer marcado (desenhado a partir da sequência flanqueadora do vetor) é utilizado para iniciar a síntese de DNA. A adição de quatro didesoxinucleotídios diferentes (o ddATP está demonstrado aqui) interrompe a síntese aleatoriamente. B. Os fragmentos resultantes são separados eletroforeticamente e submetidos à autorradiografia. A sequência inferida está demonstrada à direita. C. Gel de sequenciamento de Sanger. (C. Loida Escote-Carlson, Ph.D.)