11.6 Ciclos de vida de bacteriófagos | Mais reguladores, óperons complexos

FIGURA 11.24 A. A parte traduzida da região líder trp contém dois códons de triptofano consecutivos. B. A sequência líder phe contém sete códons de fenilalanina. C. A sequência líder his contém sete códons de histidina consecutivos.

11.6 Ciclos de vida de bacteriófagos | Mais reguladores,

óperons complexos

Naquele cinema em Paris, François Jacob teve um lampejo de que o fenômeno da indução do prófago pudesse ser análogo de modo próximo à indução da síntese de β-galactosidase. Ele estava certo. Aqui, veremos como o ciclo de vida do bacteriófago λ é regulado. Embora a sua regulação seja mais complexa do que aquela dos óperons individuais, ela é controlada por modos de regulação gênica agora familiares.

O bacteriófago λ é um assim denominado fago temperado, que apresenta dois ciclos de

vida alternativos (Figura 11.25). Quando uma bactéria normal é infectada por um fago λ do tipo selvagem, podem se seguir dois possíveis desfechos: (1) o fago pode se replicar e finalmente lisar a célula (o ciclo lítico), ou (2) o genoma do fago pode integrar-se ao cromossomo bacteriano como um prófago inerte (o ciclo lisogênico). No estado lítico, a maior parte dos 71 genes do fago é expressa em algum ponto, enquanto no estado lisogênico, a maior parte dos genes está inativa.

O que decide qual dessas duas vias é adotada? O controle fisiológico da decisão entre a

via lítica ou lisogênica depende dos recursos disponíveis na bactéria hospedeira. Se os recursos forem abundantes, o ciclo lítico é preferido, tendo em vista que então existem nutrientes suficientes para produzir muitas cópias do vírus. Se os recursos forem limitados, a via lisogênica é adotada. O vírus então permanece presente como um prófago até que as condições melhorem. O prófago inerte pode ser induzido por luz ultravioleta a entrar no ciclo lítico — o fenômeno estudado por Jacob. Os estados lítico e lisogênico são caracterizados por programas muito distintos de expressão gênica que devem ser regulados. Qual estado alternativo é selecionado é determinado por um interruptor genético complexo que compreende diversas proteínas reguladoras de ligação ao DNA e um conjunto de sítios operadores.

FIGURA 11.25 Se o bacteriófago λ entra imediatamente no ciclo lítico ou se entra no ciclo lisogênico depende da disponibilidade de recursos. O vírus lisogênico insere seu genoma no cromossomo bacteriano, onde ele permanece quiescente até que as condições sejam favoráveis.

Assim como o foram para os sistemas reguladores lac e outros, as análises genéticas de

mutantes foram fonte de percepções cruciais sobre os componentes e a lógica do interruptor genético de λ. Jacob utilizou triagens fenotípicas simples para isolar mutantes que eram defeituosos na via lítica ou na lisogênica. Os mutantes de cada tipo puderam ser reconhecidos pelo aspecto das placas infectadas em uma camada de bactérias. Quando partículas de fago do tipo selvagem são colocadas em uma camada de bactérias sensíveis, aparecem áreas claras (denominadas “placas”) onde as bactérias são infectadas e lisadas, mas essas placas são turvas, tendo em vista que bactérias lisogenizadas crescem nelas

(Figura 11.26). Os fagos mutantes que formam placas claras são incapazes de lisogenizar as células.

Os referidos mutantes claros (denominados por c) são análogos aos mutantes I e O do

sistema lac. Esses mutantes com frequência foram isolados como mutantes sensíveis à temperatura que apresentavam fenótipos claros em temperaturas mais altas, mas fenótipos do tipo selvagem em temperaturas mais baixas. Três classes de mutantes levaram à identificação das características reguladoras-chave do fago λ. Na primeira classe, os mutantes para os genes cI, cII e cIII formam placas claras; ou seja, eles são incapazes de estabelecer a lisogenia. Foi isolada uma segunda classe de mutantes que não lisogeniza as células, mas que pode se replicar e entrar no ciclo lítico em uma célula lisogenizada. Esses mutantes são análogos aos mutantes constitutivos do operador do sistema lac. Um terceiro mutante-chave consegue lisogenizar, mas é incapaz de lisar as células. O gene mutado nesse caso é o gene cro (em referência ao controle do repressor e de outras coisas). A decisão entre as vias lítica e lisogênica depende da atividade das proteínas codificadas pelos quatro genes cI, cII, cIII, e cro, três dos quais são proteínas de ligação ao DNA.

FIGURA 11.26 As placas são claras onde ocorreu a lise da célula hospedeira; elas são turvas onde as células sobreviveram à infecção e continuaram a crescer como um lisógeno. (De Microbiology An Evolving Science, 1st ed., Figure 10.22. © John Foster.)

Primeiramente enfocaremos os dois genes cI e cro nas proteínas que eles codificam

(Tabela 11.4). O gene cI codifica um repressor, com frequência denominado repressor λ, que reprime o crescimento lítico e promove a lisogenia. O gene cro codifica um repressor que reprime a lisogenia, possibilitando, assim, o crescimento lítico. O interruptor genético que controla os dois ciclos de vida do fago λ apresenta dois estados: no estado lisogênico, cI está ligado, mas cro está desligado, e no ciclo lítico, cro está ligado, mas cI está desligado. Portanto, o repressor λ e Cro estão competindo, e o repressor que prevalece determina o estado do interruptor e da expressão do genoma λ.

A corrida entre o repressor λ e o Cro é iniciada quando o fago λ infecta uma bactéria

normal. A sequência de eventos na corrida é criticamente determinada pela organização dos genes no genoma λ e dos promotores e operadores entre os genes cI e cro. O genoma λ de aproximadamente 50 kb codifica proteínas que apresentam papéis na replicação do DNA, na

recombinação, na montagem da partícula do fago e na lise celular (Figura 11.27). Essas proteínas são expressas em uma sequência lógica tal que primeiramente são produzidas cópias do genoma; essas cópias em seguida são empacotadas em partículas virais e, finalmente, a célula hospedeira é lisada para liberar o vírus e iniciar a infecção de outras

células hospedeiras (ver Figura 11.25). A ordem da expressão gênica viral flui a partir do início da transcrição em dois promotores, PL e PR (em referência a promotor à esquerda e à direita em relação ao mapa genético). Com a infecção, a RNA polimerase inicia a

transcrição em ambos os promotores. Observando o mapa genético (ver Figura 11.27), vemos que a partir de P R, cro é o primeiro gene transcrito, e a partir de PL, N é o primeiro gene transcrito.

O gene N codifica um regulador positivo, mas o mecanismo dessa proteína difere daquele

de outros reguladores que consideramos até agora. A proteína N possibilita que a RNA polimerase continue a transcrever regiões do DNA que de outro modo causariam o término da transcrição. Uma proteína reguladora tal como N, que atua impedindo o término da transcrição, é denominada antiterminalizador. Portanto, N possibilita a transcrição de cIII e outros genes à esquerda de N, bem como de cII e outros genes à direita de cro. O gene cII codifica uma proteína ativadora que se liga a um sítio que promove a transcrição à esquerda de um promotor diferente, P RE (em referência a promotor de estabelecimento do repressor), que ativa a transcrição do gene cI. Relembre que o gene cI codifica o repressor λ, que evitará o crescimento lítico.

Tabela 11.4 Principais reguladores do ciclo de vida do bacteriófago λ.

Gene Proteína Promove

cI repressor λ via lisogênica

cro repressor Cro via lítica

N regulador positivo expressão de cII, cIII

cII ativador expressão de cI

cIII inibidor de protease atividade de cII

FIGURA 11.27 Mapa do fago λ na forma circular. Os genes para recombinação, integração e excisão, replicação, montagem da cabeça e da cauda e lise celular estão agrupados juntos e são regulados de modo coordenado. A transcrição do lado direito do genoma tem início em PR, e aquela dos genes à esquerda tem início em P . Interações reguladoras-chave que regulam a decisão lisogênica versus lítica ocorrem nos L

operadores entre os genes cro e cI.

Antes de ocorrer a expressão do restante dos genes virais, deve ser tomada uma “decisão”

— continuar com a expressão do gene viral e lisar a célula, ou reprimir aquela via e lisogenizar a célula. A decisão de lisar ou lisogenizar uma célula depende da atividade da proteína cII. A proteína cII é instável, tendo em vista que é sensível a proteases bacterianas — enzimas que degradam proteínas. Essas proteases respondem às condições ambientais: elas são mais ativas quando os recursos são abundantes, mas menos ativas quando as células estão em inanição.

Vejamos o que ocorre com cII quando os recursos são abundantes e não abundantes.

Quando os recursos são abundantes, cII é degradado e pouco repressor λ é produzido. Os genes transcritos a partir de P L e PR continuam a ser expressos, e o ciclo lítico prevalece. Entretanto, se os recursos são limitados, cII é mais ativo e mais repressor λ é produzido. Nesse caso, os genes transcritos a partir de PL e PR são reprimidos pelo repressor λ e ocorre a entrada no ciclo lisogênico. A proteína cII também é responsável pela ativação da transcrição de int, um gene que codifica uma proteína adicional necessária para a lisogenia — uma integrase necessária para a integração do genoma λ ao cromossomo hospedeiro. A proteína cIII protege cII da degradação; assim, ela também contribui para a decisão lisogênica.

Recapitulemos brevemente a sequência de eventos e os pontos de decisão no ciclo de vida

do bacteriófago λ:

Com a infecção:

A RNA polimerase do hospedeiro inicia a transcrição em P e P , expressando os genes cro e N. L R

Em seguida:

A proteína antiterminalizadora N possibilita a transcrição do gene cIII e dos genes de recombinação (ver Figura 11.27,

esquerda), bem como do gene cII e outros genes (ver Figura 11.27, direita).

Em seguida:

A proteína cII, protegida pela proteína cIII, liga cI e int por meio da ativação da transcrição em PRE.

Em seguida:

Se os recursos e as proteases forem abundantes, cII é degradada, Cro reprime cI, e o ciclo lítico continua.

Se os recursos e as proteases não forem abundantes, cII está ativa, a transcrição de cI prossegue em um nível alto, a proteína Int integra-se ao cromossomo do fago, e cI (repressor λ) desliga todos os genes, exceto a si próprio.