Introdução à Genética
Genes controlados juntos
Quando Jacob e Monod induziram a β-galactosidase, eles observaram que também induziram a enzima permease, que é necessária para transportar a lactose para dentro da célula. A análise de mutantes indicou que cada enzima era codificada por um gene diferente. A enzima transacetilase (com uma função dispensável e ainda desconhecida) também foi induzida juntamente com a β-galactosidase e a permease e posteriormente foi demonstrado que ela é codificada por um gene em separado. Portanto, Jacob e Monod puderam identificar três genes controlados de modo coordenado. O mapeamento de recombinação demonstrou que os genes Z, Y e A estavam ligados de modo muito próximo no cromossomo.
Evidências genéticas do operador e do repressor Agora chegamos ao centro do trabalho de Jacob e Monod: como eles deduziram os mecanismos de regulação gênica no sistema lac? Sua estratégia foi uma abordagem genética clássica: examinar as consequências fisiológicas das mutações. Portanto, eles induziram mutações nos genes estruturais e nos elementos reguladores do óperon lac. Conforme veremos, as propriedades das mutações nesses diferentes componentes do óperon lac são consideravelmente diferentes, e forneceram indicações importantes para Jacob e Monod.
Os indutores naturais, tais como a alolactose, não são ideais para esses experimentos,
tendo em vista que são degradados pela β-galactosidase. A concentração do indutor diminui durante o experimento e, assim, as medições da indução enzimática se tornam consideravelmente complicadas. Em vez disso, para os referidos experimentos, Jacob e Monod utilizaram indutores sintéticos, tais como o isopropil-β-D-tiogalactosídeo (IPTG;
Figura 11.7). O IPTG não é hidrolisado pela β-galactosidase, mas ainda induz a expressão da enzima β-galactosidase.
Jacob e Monod observaram que diversas classes diferentes de mutações podem alterar a
expressão dos genes estruturais do óperon lac. Eles estavam interessados na avaliação das interações dos novos alelos, tais como quais alelos exibiam dominância. Mas para realizar os referidos testes, são necessários diploides, e bactérias são haploides. Entretanto, Jacob e Monod foram capazes de produzir bactérias que são parcialmente diploides por meio da
inserção de fatores F′ (ver Capítulo 5) que carregam a região lac do genoma. Eles então conseguiram criar linhagens que eram heterozigotas em relação a mutações lac selecionadas. Esses diploides parciais possibilitaram que Jacob e Monod distinguissem mutações no sítio do DNA regulador (o operador lac) a partir de mutações na proteína reguladora (o repressor Lac codificado pelo gene I).
FIGURA 11.7 O IPTG é um indutor do óperon lac.
Iniciamos por meio do exame de mutações que inativam os genes estruturais para β-
galactosidase e permease (respectivamente designados Z— e Y—). A primeira coisa que aprendemos é que Z— e Y— são recessivos em relação aos seus respectivos alelos do tipo
selvagem (Z+ e Y+). Por exemplo, a linhagem 2 na Tabela 11.1 pode ser induzida a sintetizar β-galactosidase (assim como a linhagem 1 haploide do tipo selvagem na tabela) ainda que seja heterozigota em relação aos alelos Z mutante e selvagem. Isso demonstra que o alelo Z+ é dominante em relação ao seu correspondente Z—.
Jacob e Monod primeiramente identificaram duas classes de mutações reguladoras,
denominadas OC e I—. Essas foram denominadas mutações constitutivas, tendo em vista que causaram a expressão dos genes estruturais do óperon lac independentemente da presença do indutor. Jacob e Monod identificaram a existência do operador com base em sua análise das mutações OC. Essas mutações tornam o operador incapaz de se ligar ao repressor; elas danificam o interruptor de tal modo que o operador está sempre “ligado”
(Tabela 11.1, linhagem 3). De importância, os efeitos constitutivos das mutações OC foram restritos somente àqueles genes estruturais lac no mesmo cromossomo da mutação OC. Por isso, o operador mutante foi denominado de ação cis, conforme demonstrado pelo fenótipo
da linhagem 4 na Tabela 11.1. Aqui, tendo em vista que o gene da permease do tipo selvagem (Y+) é cis em relação ao operador do tipo selvagem, a permease é expressa apenas quando a lactose ou um análogo estão presentes. Contrariamente, o gene da β-galactosidase do tipo selvagem (Z+) é cis em relação ao operador mutante OC; portanto, a β-galactosidase é expressa constitutivamente. Essa propriedade incomum da ação cis sugeriu que o operador é um segmento de DNA que influencia apenas a expressão dos genes estruturais ligados a ele
(Figura 11.8). Portanto, o operador atua simplesmente como um sítio de ligação à proteína e não faz produto gênico.
Jacob e Monod realizaram testes genéticos comparáveis com as mutações I— (Tabela
11.2). Uma comparação da linhagem I+ do tipo selvagem indutível (linhagem 1) com linhagens I— demonstra que as mutações I— são constitutivas (linhagem 2). Ou seja, elas causam a expressão dos genes estruturais o tempo todo. A linhagem 3 demonstra que o fenótipo indutível de I+ é dominante em relação ao fenótipo constitutivo de I—. Esse achado demonstrou a Jacob e Monod que a quantidade de proteína do tipo selvagem codificada por uma cópia do gene é suficiente para regular ambas as cópias do operador em uma célula diploide. Mais significativamente, a linhagem 4 demonstrou a eles que o produto do gene I+ é transatuante, o que significa que o produto do gene consegue regular todos os genes estruturais do óperon lac, estejam eles localizados na mesma molécula de DNA ou em moléculas diferentes (em cis ou em trans, respectivamente). Contrariamente ao operador, o gene I se comporta como um gene-padrão codificador de proteína. O produto proteico do gene I é capaz de se difundir por uma célula e atuar sobre ambos os operadores no diploide
parcial (Figura 11.9).
Tabela 11.1 Síntese de β-galactosidase e permease em mutantes operadores haploides e diploides heterozigotos.
β-galactosidase (Z) Permease (Y)
Não Não
Linhagem Genótipo induzida Induzida induzida Induzida Conclusão
1 O+ Z+ Y+ — + — + O tipo
selvagem é
indutível
2 O+ Z+ — + — + Z+ é
Y+/F′ O+ Z dominante
— + Y