Introdução à Genética
DNA polimerases
FIGURA 7.14 Um cromossomo bacteriano replicando apresenta duas forquilhas de replicação. A. Esquerda: autorradiografia de um cromossomo bacteriano após uma replicação em timidina tritiada. De acordo com o modelo de replicação semiconservativa, um dos dois filamentos deve ser radioativo. Direita: interpretação da autorradiografia. A hélice amarela representa o filamento tritiado. B. Esquerda: autorradiografia de um cromossomo bacteriano na segunda rodada da replicação em timidina tritiada (3H). Nesta molécula, a dupla-hélice recentemente replicada que cruza o círculo pode ser composta por dois filamentos radioativos (se o filamento parental for o filamento radioativo). Direita: a espessura dupla do traçado radioativo no autorradiograma aparenta confirmar a interpretação demonstrada aqui.
DNA polimerases
Um problema confrontado pelos cientistas era compreender justamente como as bases são trazidas até o molde da dupla-hélice. Embora os cientistas suspeitassem que enzimas desempenhassem um papel, essa possibilidade não foi comprovada até 1959, quando Arthur Kornberg isolou a DNA polimerase de E. coli e demonstrou sua atividade enzimática in vitro. Essa enzima adiciona desoxirribonucleotídios na extremidade 3′ de uma cadeia de nucleotídios em crescimento, utilizando como molde um filamento único de
DNA que foi exposto pela deselicoidização localizada da dupla-hélice (Figura 7.15). Os substratos para a DNA polimerase são as formas trifosfato dos desoxirribonucleotídios, dATP, dGTP, dCTP e dTTP. A adição de cada base ao polímero em crescimento é acompanhada pela remoção de dois dos três fosfatos na forma de pirofosfato (PPi). A energia produzida pela clivagem dessa ligação de alta energia e a subsequente hidrólise do pirofosfato em duas moléculas de fosfato inorgânico auxiliam no direcionamento do processo endergônico de construção de um polímero de DNA.
Atualmente sabe-se que existem cinco DNA polimerases na E. coli. A primeira enzima
que Kornberg purificou atualmente é denominada DNA polimerase I, ou pol I. Essa enzima apresenta três atividades, que aparentam estar localizadas em diferentes partes da molécula:
1. Uma atividade de polimerase, que catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5′ para
3′.
2. Uma atividade de exonuclease 3′ para 5′, que remove bases incorretamente pareadas.
3. Uma atividade de exonuclease 5′ para 3′, que degrada filamentos únicos de DNA ou
RNA.
Retornaremos à significância das duas atividades de exonuclease posteriormente neste capítulo.
Embora a pol I atue na replicação do DNA (ver próxima seção), alguns cientistas
suspeitavam de que ela não fosse responsável pela maior parte da síntese do DNA, tendo em vista que ela era muito lenta (aproximadamente 20 nucleotídios/s) e muito abundante (aproximadamente 400 moléculas/célula), além de se dissociar do DNA após a incorporação de apenas 20 a 50 nucleotídios. Em 1969, John Cairns e Paula DeLucia resolveram essa questão quando demonstraram que uma linhagem de E. coli com uma mutação no gene que codifica a DNA pol I ainda era capaz de crescer normalmente e replicar o seu DNA. Eles concluíram que outra DNA polimerase, atualmente denominada pol III, catalisa a síntese de DNA na forquilha de replicação.