Introdução à Genética
10.1 Visão geral | Isolamento e amplificação de fragmentos específicos de DNA
métodos apresentados nos Capítulos 2 e 4, podem ser utilizados em conjunto para isolar e identificar um gene.
10.1 Visão geral | Isolamento e amplificação de
fragmentos específicos de DNA
Como um segmento de DNA específico pode ser isolado de um genoma inteiro? Além disso, como ele pode ser isolado em quantidades suficientes para analisar as características do DNA, tais como a sua sequência de nucleotídios e o seu produto proteico? Uma percepção crucial para a solução desse problema foi que os pesquisadores poderiam utilizar o
maquinário de replicação do DNA (ver Capítulo 7) para replicar o segmento de DNA em questão. A referida replicação é denominada amplificação. Ela pode ser realizada em células bacterianas vivas (in vivo) ou em um tubo de ensaio (in vitro).
Na abordagem in vivo (Figura 10.1 A), um investigador inicia com uma
amostra de moléculas de DNA que contêm o gene de interesse. Essa amostra é denominada DNA doador e, na maioria das vezes, é um genoma inteiro. Fragmentos do DNA doador são inseridos em um plasmídio ou vírus bacteriano especialmente projetado, que “transportará” e amplificará o gene de interesse e que, portanto, são denominados vetores. Primeiramente, as moléculas do DNA doador são cortadas por meio da utilização de enzimas denominadas endonucleases de restrição como “tesouras” moleculares. Elas cortam longas moléculas de DNA do tamanho de cromossomos em centenas ou milhares de fragmentos de tamanho mais manuseável. Em seguida, cada fragmento é inserido em um cromossomo vetor que foi cortado para formar moléculas de DNA recombinante. As moléculas de DNA recombinante são transferidas para células bacterianas e, em geral, apenas uma molécula recombinante é captada por célula. Dentro da célula bacteriana, a molécula recombinante é amplificada juntamente com o vetor durante a divisão celular. A partir de uma única célula, esse processo resulta em um clone de células idênticas, cada um contendo a molécula de DNA recombinante e, assim, essa técnica de amplificação é denominada clonagem de DNA. Tendo em vista que muitos fragmentos de DNA são inseridos no vetor, a mistura de células resultante contém coletivamente tanto quanto o genoma inteiro do organismo doador. O próximo estágio é encontrar o clone raro que contém o DNA de interesse entre as muitas células.
FIGURA 10.1 Dois métodos de isolamento e amplificação de um gene são (A) in vivo, enganando-se o maquinário de replicação de uma bactéria para que amplifique o DNA recombinante que contém o gene, e (B) in vitro, em tubo de ensaio, com a utilização da técnica de reação da cadeia de polimerase. Ambos os métodos empregam os princípios básicos da biologia molecular: a capacidade de proteínas específicas (vermelhas e verdes) de se ligarem ao DNA e a capacidade de segmentos de ácidos nucleicos unifilamentares complementares hibridizarem (o primer utilizado no método do tubo de ensaio).
Na abordagem in vitro, denominada reação da cadeia de polimerase
(PCR) (Figura 10.1 B), um gene específico ou uma região do DNA de interesse são isolados e amplificados pela DNA polimerase. A PCR “encontra” a região do DNA de interesse (denominada DNA-alvo) por meio da ligação complementar de moléculas de DNA sintéticas curtas específicas, denominadas primers, às extremidades daquela sequência. Esses primers em seguida guiam o processo de replicação direcionado pela DNA polimerase, que ocorre em ciclos exponenciais, resultando na produção de grandes quantidades do DNA-alvo como um fragmento de DNA isolado. Quantidades ainda maiores de DNA-alvo podem ser obtidas por meio da inserção do produto da PCR em um plasmídio (ou seja, o método in vivo), gerando, portanto, uma molécula de DNA recombinante como aquela descrita anteriormente.
Veremos repetidamente que a tecnologia do DNA depende de dois
fundamentos básicos da pesquisa em biologia molecular:
• A capacidade de proteínas específicas reconhecerem e se ligarem a
sequências de bases específicas dentro da dupla-hélice do DNA (os
exemplos estão demonstrados em verde e em vermelho na Figura 10.1)
• A capacidade de sequências unifilamentares de DNA ou de RNA
complementares parearem para formar moléculas bifilamentares (um
exemplo é a ligação dos primers demonstrada em amarelo na Figura
10.1).
O restante do capítulo explorará algumas aplicações do DNA amplificado. Essas aplicações variam desde o isolamento gênico de rotina para pesquisas biológicas básicas, passando pela terapia gênica para tratar doenças humanas, e chegando até a produção de herbicidas e pesticidas para plantações. Para ilustrar como o DNA recombinante é produzido, consideraremos a clonagem do gene da insulina humana, um hormônio proteico utilizado no tratamento do diabetes. O diabetes melito é uma doença na qual os níveis de açúcar no sangue estão anormalmente altos, seja em virtude de o corpo não produzir insulina suficiente (diabetes tipo I) ou de as células serem incapazes de responder à insulina (diabetes tipo II). Formas brandas de diabetes tipo I podem ser tratadas por meio de restrições alimentares, mas, para muitos pacientes, são necessários tratamentos diários com insulina. Até aproximadamente 30 anos atrás, as vacas eram a principal fonte da proteína insulina, que era obtida a partir do pâncreas de animais abatidos em frigoríficos e purificada em grande escala para eliminar a maioria das proteínas e outros contaminantes dos extratos de pâncreas. Em seguida, em 1982, a primeira insulina humana recombinante chegou ao mercado. A insulina humana pode ser produzida em uma forma mais pura, a um custo mais baixo e em escala industrial, por ser produzida em maiores quantidades em bactérias por meio de técnicas do DNA recombinante que utilizam a sequência real do gene da insulina humana. Além disso, não há o risco de introdução de vírus bovinos ou de uma resposta imune contra a insulina bovina. Utilizaremos o isolamento e a produção da insulina recombinante como um exemplo das etapas gerais necessárias para a produção de qualquer DNA recombinante.