Introdução à Genética
Caracterização molecular do repressor Lac e do operador lac
polimerase, conforme descrito no Capítulo 8. Existem duas regiões de ligação para a RNA
polimerase em um promotor procariótico típico, demonstradas na Figura 11.11 como as duas regiões altamente conservadas em —35 e —10. As mutações do promotor são de ação cis, pois afetam a transcrição de todos os genes estruturais adjacentes no óperon. Assim como os operadores e outros elementos de ação cis, os promotores são sítios na molécula de DNA que são ligados a proteínas e eles próprios não dão origem a produto proteico.
Caracterização molecular do repressor Lac e do operador lac Walter Gilbert e Benno Müller-Hill forneceram uma demonstração decisiva do sistema lac em 1966 por meio do monitoramento da ligação do indutor IPTG marcado radioativamente à proteína repressora purificada. Primeiramente eles demonstraram que o repressor é composto por quatro subunidades idênticas e, portanto, contém quatro sítios de ligação de IPTG (e, portanto, de ligação de alolactose). Em segundo lugar, eles demonstraram que, no tubo de ensaio, a proteína repressora se liga a um DNA que contém o operador e que sai do DNA na presença de IPTG. (Uma descrição mais detalhada sobre como o repressor e outras proteínas de ligação ao DNA atuam é fornecida posteriormente, no fim da Seção 11.6.)
Gilbert e seus colaboradores demonstraram que o repressor pode proteger bases
específicas no operador contra reagentes químicos. Essa informação possibilitou que eles isolassem o segmento de DNA que constitui o operador e determinassem a sua sequência. Eles usaram o DNA do óperon ao qual o repressor estava ligado e o trataram com a enzima DNase, que fragmenta o DNA. Foram capazes de recuperar trechos curtos de DNA que haviam sido protegidos da atividade enzimática pela molécula repressora. Esses trechos curtos presumivelmente constituíam a sequência do operador. A sequência de bases de cada filamento foi determinada, e foi demonstrado que cada mutação no operador é uma alteração
na sequência (Figura 11.12). Esses resultados demonstraram que o locus operador é uma sequência específica de 17 a 25 nucleotídios situados logo antes (em 5′) do gene estrutural Z. Eles também demonstraram a incrível especificidade do reconhecimento do repressor– operador, que pode ser rompida pela substituição de uma única base. Quando a sequência de bases no mRNA lac (transcrito a partir do óperon lac) foi determinada, as primeiras 21 bases na extremidade de iniciação 5′ comprovaram ser complementares à sequência do operador que Gilbert havia determinado, demonstrando que a sequência operadora é transcrita.
Os resultados desses experimentos forneceram confirmações cruciais sobre o mecanismo
da ação repressora formulado por Jacob e Monod.