Introdução à Genética
Cruzamento-teste de três pontos
Existe uma forte implicação de que a “distância” em um mapa de ligação seja
uma distância física ao longo de um cromossomo, e Morgan e Sturtevant certamente queriam dizer exatamente isso. Mas devemos perceber que o mapa de ligação é uma entidade hipotética construída a partir de uma análise puramente genética. O mapa de ligação poderia ter sido derivado até mesmo sem se saber que existiam cromossomos. Além disso, nesse ponto na nossa discussão, não podemos dizer se as “distâncias genéticas” calculadas por meio das frequências de recombinantes representam as distâncias físicas reais nos cromossomos. Entretanto, os mapas físicos demonstraram que as distâncias genéticas são, de fato, aproximadamente proporcionais às distâncias baseadas em recombinação. Existem exceções causadas por hotspots (“pontos quentes”) de recombinação, locais no genoma em que o crossing over ocorre de modo mais frequente do que o habitual. A presença de hotspots causa a expansão proporcional de algumas regiões do mapa. Também são conhecidos bloqueios de recombinação, que apresentam o efeito oposto.
Um resumo do modo como os recombinantes do crossing over são utilizados no
mapeamento está demonstrado na Figura 4.9. Os crossovers ocorrem mais ou menos aleatoriamente ao longo do par cromossômico. Em geral, nas regiões mais longas, o número médio de crossovers é mais alto e, de acordo com isso, recombinantes são obtidos com mais frequência, o que se traduz em uma distância de mapa mais longa.
CONCEITO-CHAVE A recombinação entre genes ligados pode ser utilizada para mapear a sua distância em
um cromossomo. A unidade de mapeamento (1 u.m.) é de nida como uma frequência de recombinantes
de 1%.
Cruzamento-teste de três pontos
Até agora, observamos a ligação em cruzamentos de di-híbridos (heterozigotos duplos) com testadores recessivos duplos. O próximo nível de complexidade é um cruzamento de um tri-híbrido (heterozigoto triplo) com um testador recessivo triplo. Esse tipo de cruzamento, denominado cruzamento-teste de três pontos ou cruzamento de três fatores, é comumente utilizado na análise de ligação. O objetivo é deduzir se três genes estão ligados e, caso afirmativo, deduzir a sua ordem e as distâncias de mapa entre eles.
Observemos um exemplo, também da Drosophila. No nosso exemplo, os alelos
mutantes são v (olhos vermelhos), cv (ausência de nervuras nas asas) e ct (bordas das asas aparadas, ou cortadas). A análise é feita por meio da realização dos cruzamentos a seguir:
FIGURA 4.9 Crossovers produzem cromátides recombinantes cuja frequência pode ser utilizada para mapear os genes em um cromossomo. Regiões mais longas produzem mais crossovers. O marrom demonstra os recombinantes em relação àquele intervalo.
Fêmeas tri-híbridas são submetidas ao cruzamento-teste com machos recessivos triplos:
A partir de qualquer tri-híbrido, são possíveis apenas 2 × 2 × 2 = 8 genótipos de gameta. Eles são os genótipos observados na progênie do cruzamento-teste. O quadro a seguir demonstra o número de cada um dos oitos genótipos gaméticos em uma amostra de 1.448 moscas da progênie. As colunas laterais demonstram quais genótipos são recombinantes (R) em relação aos loci, considerando-se dois de cada vez. É preciso que sejamos cuidadosos em nossa classificação dos tipos parentais e recombinantes. Observe que os genótipos parentais que entram para os heterozigotos triplos são v+ · cv · ct e v · cv+ · ct+; qualquer outra combinação além dessas duas constitui um recombinante.
Recombinantes em relação aos loci
Gametas v e cv v e ct cv e ct
v · cv+ · ct+ 580
v+ · cv · ct 592
v · cv · ct+ 45 R R
v+ · cv+ · ct 40 R R
v · cv · ct 89 R R
v+ · cv+ · ct+ 94 R R
v · cv+ · ct 3 R R
v+ · cv · ct+ 5 R R
1.448 268 191 93
Analisemos os loci, dois por vez, iniciando com os loci v e cv. Em outras palavras, observamos apenas as primeiras duas colunas sob “Gametas” e cobrimos a terceira coluna. Tendo em vista que os parentais em relação a esse par de loci são v+ · cv e v · cv+, sabemos que os recombinantes são, por definição, v · cv e v+ · cv+. Existem 45 + 40 + 89 + 94 = 268 desses recombinantes. De um total de 1.448 moscas, esse número fornece uma FR de 18,5%.
Em relação aos loci v e ct, os recombinantes são v · ct e v+ · ct+. Existem 89 + 94
+ 3 + 5 = 191 desses recombinantes entre 1.448 moscas e, assim a FR = 13,2%.
Em relação a ct e cv, os recombinantes são cv · ct+ e cv+ · ct. Existem 45 + 40 + 3
+ 5 = 93 desses recombinantes entre as 1.448 e, assim, a FR = 6,4%.
Claramente, todos os loci estão ligados, tendo em vista que os valores das FR são
todos consideravelmente inferiores a 50%. Tendo em vista que os loci v e cv apresentam o maior valor da FR, eles têm de ser os mais distantes. Assim, o locus ct encontra-se obrigatoriamente entre eles. Pode ser desenhado um mapa como segue:
O cruzamento-teste pode ser reescrito como segue, agora que sabemos o arranjo de ligação:
v+ ct cv/v ct+ cv+ × v ct cv/v ct cv
Aqui, observe diversos pontos importantes. Primeiramente, deduzimos uma ordem dos genes que é diferente daquela utilizada em nossa lista dos genótipos da progênie. Tendo em vista que o ponto do exercício era determinar a relação de ligação desses genes, a lista original era de necessidade arbitrária; a ordem simplesmente não era conhecida antes de os dados serem analisados. Daqui por diante, os genes têm de ser escritos na ordem correta.
Em segundo lugar, estabelecemos definitivamente que ct está entre v e cv. No
diagrama, posicionamos v arbitrariamente à esquerda e cv à direita, mas o mapa poderia ser igualmente bem-desenhado com o posicionamento invertido desses loci.
Em terceiro lugar, observe que os mapas de ligação meramente mapeiam os loci
em relação uns aos outros, com a utilização das unidades de mapa padrão. Não sabemos onde os loci estão em um cromossomo — ou até mesmo em qual cromossomo específico eles estão. Nas análises subsequentes, na medida em que mais loci forem mapeados em relação a esses três, o mapa cromossômico completo seria “concluído”.
CONCEITO-CHAVE Cruzamentos-teste de três pontos (e superiores) possibilitam que os geneticistas
avaliem a ligação entre três (ou mais) genes e determinem a ordem dos genes, tudo em um cruzamento.
Por fim, é preciso que as duas distâncias de mapa menores, 13,2 u.m. e 6,4 u.m.,
somam 19,6 u.m., que é superior a 18,5 u.m., a distância calculada em relação a v e cv. Por quê? A resposta dessa questão está no modo como tratamos as duas classes de progênie mais raras (que totalizam 8) em relação à recombinação de v e cv. Agora que temos o mapa, podemos observar que essas duas classes raras são de fato
recombinantes duplos, que surgem a partir de dois crossovers (Figura 4.10). Entretanto, quando calculamos o valor da FR em relação a v e cv, não contamos os genótipos v ct cv+ e v+ ct+ cv; afinal, em relação a v e cv, eles são combinações parentais (v cv+ e v+ cv). À luz do nosso mapa, entretanto, observamos que esse descuido nos levou a subestimar a distância entre os loci v e cv. Não apenas deveríamos ter contato as duas classes mais raras, como deveríamos ter contato cada uma delas duas vezes, tendo em vista que cada uma representa recombinantes duplos. Portanto, podemos corrigir o valor ao adicionar os números 45 + 40 + 89 + 94 + 3 + 3 + 5 + 5 = 284. Do total de 1.448, essa quantidade é exatamente 19,6%, que é idêntica à soma dos dois valores componentes. (Na prática, não necessitamos desse cálculo, tendo em vista que a soma das duas distâncias mais curtas nos fornece a melhor estimativa da distância geral.)