Introdução à Genética
Proteína Gal4 apresenta domínios de ligação ao DNA e ativação separados
contém quatro sítios de ligação Gal4 (Figura 12.6). Cada sítio de ligação Gal4 apresenta de 17 pares de bases de comprimento e está ligado por um dímero da proteína Gal4. Também existem dois sítios de ligação Gal4 upstream do gene GAL2 e outros dois upstream do gene GAL7. Esses sítios de ligação são necessários para a ativação gênica in vivo. Se eles são deletados, os genes são silenciados, até mesmo na presença de galactose. Essas sequências reguladoras são acentuadores. A presença de acentuadores localizados a uma distância linear considerável do promotor de um gene eucariótico é típica. Tendo em vista que os acentuadores ativados por Gal4 estão localizados upstream (5′) dos genes que eles regulam, eles também são denominados sequências de ativação upstream (UAS).
CONCEITO-CHAVE A ligação de proteínas de ligação ao DNA sequência-especí cas a regiões
fora dos promotores dos genes-alvo é uma característica comum da regulação da transcrição
eucariótica.
Proteína Gal4 apresenta domínios de ligação ao DNA e
ativação separados
Após a ligação de Gal4 ao elemento UAS, como a expressão gênica é induzida? É necessário um domínio distinto da proteína Gal4, o domínio de ativação, para a atividade reguladora. Portanto, a proteína Gal4 apresenta no mínimo dois domínios: um para a ligação ao DNA e outro para a ativação da transcrição. Observou-se que uma organização modular semelhante é uma característica comum também de outros fatores de transcrição de ligação ao DNA.
A organização modular da proteína Gal4 foi demonstrada em uma série
de experimentos. A estratégia era testar a ligação ao DNA e a ativação gênica de formas mutantes da proteína nas quais partes haviam sido deletadas ou fundidas a outras proteínas. Dessa maneira, os investigadores puderam determinar se uma parte da proteína era necessária para uma função em particular. Para realizar esses estudos, os experimentadores necessitavam de um meio simples para analisar a expressão das enzimas codificadas pelos genes GAL.
A expressão dos genes GAL e outros alvos de fatores de transcrição é
tipicamente monitorada por meio da utilização de um gene repórter, cujo nível de expressão é facilmente medido. Nos construtos de gene repórter, ele é ligado a sequências reguladoras que determinam a expressão do gene que está sendo investigado. A expressão do gene repórter reflete a atividade do elemento regulador que está sendo investigado. Com frequência, o gene repórter é o gene lacZ de E. coli. O lacZ é um gene repórter eficaz, pois os produtos de sua atividade são facilmente medidos. Outro gene repórter comum é o que codifica a proteína fluorescente verde (GFP) da água-viva. Conforme a sua denominação sugere, a concentração da proteína repórter é facilmente medida pela quantidade de luz que ela emite. Para investigar o controle da expressão do gene GAL, a região codificadora de um desses genes repórter e um promotor são posicionados downstream de um elemento UAS do gene GAL. A expressão do repórter é, então, uma leitura
da atividade de Gal4 nas células (Figura 12.7 A).
Vejamos o que ocorre quando uma forma da proteína Gal4 com ausência
do domínio de ativação é expressa em leveduras. Nesse caso, os sítios de ligação do elemento UAS estão ocupados, mas nenhuma transcrição é
estimulada (Figura 12.7 B). O mesmo é verdadeiro quando outras proteínas reguladoras com ausência de domínios de ativação, tais como o repressor bacteriano LexA, são expressas nas células que contêm genes repórter com seus respectivos sítios de ligação. O resultado mais interessante é obtido quando o domínio de ativação da proteína Gal4 é inserido no domínio de ligação ao DNA da proteína LexA; a proteína híbrida agora ativa a
transcrição dos sítios de ligação de LexA (Figura 12.7 D). Experimentos adicionais de “permuta de domínio” revelaram que a função de ativação da transcrição da proteína Gal4 reside em duas pequenas regiões com comprimento de aproximadamente 50 a 100 aminoácidos. Essas duas regiões formam um domínio de ativação em separado, que auxilia no recrutamento do maquinário da transcrição para o promotor, conforme veremos posteriormente nesta seção. Esse arranjo altamente modular dos domínios de regulação de atividade é observado em muitos fatores de transcrição.
FIGURA 12.6 A proteína Gal4 ativa os genes-alvo por meio de elementos de sequência de ativação upstream (UAS). A proteína Gal4 apresenta dois domínios funcionais: um domínio de ligação ao DNA (quadrado rosa) e um domínio de ativação (oval laranja). A proteína se liga como um dímero a sequências específicas upstream dos promotores gênicos da via Gal. Alguns dos genes GAL são adjacentes (GAL1, GAL10), enquanto outros estão em cromossomos diferentes. O elemento UAS GAL1 contém quatro sítios de ligação Gal4.
FIGURA 12.7 Proteínas ativadoras da transcrição apresentam múltiplos domínios separáveis. A. A proteína Gal4 apresenta dois domínios e forma um dímero. B. A remoção experimental do domínio de ativação demonstra que a ligação ao DNA não é suficiente para a ativação gênica. C. De modo semelhante, a proteína LexA bacteriana não consegue ativar a transcrição por si própria, mas, quando fundida ao domínio de ativação Gal4 (D), consegue ativar a transcrição por meio dos sítios de ligação de LexA.