Amplificação do DNA doador em uma célula bacteriana

endonuclease de restrição nas suas extremidades 5′ (Figura 10.6). A digestão do produto final da PCR com a enzima de restrição (EcoRI nesse caso) produz um fragmento que está pronto para ser inserido em um vetor

(ver Figura 10.5 B).

Outro método adiciona extremidades coesivas a qualquer fragmento de

DNA bifilamentar — incluindo os cDNA (Figura 10.7). Oligonucleotídios bifilamentares curtos (denominados ligadores ou adaptadores) que contêm um sítio de restrição são adicionados a um tubo de ensaio que contém cDNA e ligase. A ligase une os ligadores às extremidades dos filamentos de cDNA. Após a ligação estar completa, o DNA é incubado com a enzima de restrição correspondente para gerar as extremidades coesivas necessárias

para a clonagem em um vetor plasmidial (ver Figura 10.5 B). Observe que nos exemplos demonstrados, ambos o DNA amplificado e o cDNA não devem conter um sítio de EcoRI interno, ou ele também será digerido. Se ele contiver, a sequência para um sítio de restrição que não está no DNA amplificado pode ser adicionada aos primers ou aos ligadores.

 

CONCEITO-CHAVE DNA doadores e de vetores com as mesmas extremidades coesivas podem

ser unidos e ligados com e ciência. Alternativamente, o DNA doador que é o produto da PCR

ou da síntese de cDNA requer a adição de extremidades coesivas antes da inserção em um

vetor.

 

Amplificação do DNA doador em uma célula bacteriana

A amplificação das moléculas de DNA recombinantes tira vantagem de processos genéticos procarióticos tais como a transformação bacteriana, a replicação de plasmídios e o crescimento de bacteriófagos, todos discutidos

no Capítulo 5. A Figura 10.8 ilustra a clonagem de um segmento de DNA doador. Um vetor recombinante único entra em uma célula bacteriana e é amplificado pelo mesmo maquinário que replica o cromossomo bacteriano. Uma exigência básica é a presença de uma origem de replicação do DNA reconhecida pelas proteínas de replicação do hospedeiro (conforme descrito

no Capítulo 7). Logo existem muitas cópias de cada vetor em cada célula bacteriana. Portanto, após a amplificação, uma colônia de bactérias conterá tipicamente bilhões de cópias do inserto de DNA doador único fundido ao seu vetor. Esse conjunto de cópias amplificadas do fragmento de DNA doador único dentro do vetor de clonagem é o clone de DNA recombinante.

FIGURA 10.6 Adição de sítios de EcoRI nas extremidades de produtos da PCR. A. Um par de primers de PCR é desenhado de modo que as suas extremidades 3′ unam-se à sequência-alvo, enquanto suas extremidades 5′ contenham sequências que codificam o sítio da enzima de restrição (EcoRI neste caso). Dois nucleotídios adicionais (aleatórios) são adicionados à extremidade 5’, tendo em vista que as enzimas de restrição necessitam de sequências em ambos os lados da sequência de reconhecimento para o corte eficiente. O DNA-alvo é desnaturado, e as extremidades 5′ com os sítios de restrição permanecem unifilamentares, enquanto o restante dos primers pareia e é estendido pela DNA polimerase. B. Na segunda rodada da PCR — apenas os filamentos recém-sintetizados estão demonstrados — os primers de DNA pareiam novamente, e dessa vez a síntese do DNA produz moléculas de DNA bifilamentares como a PCR convencional, mas essas moléculas apresentam sítios de restrição em uma extremidade. C. Os produtos da segunda rodada e de todas as rodadas subsequentes apresentam sítios de EcoRI em ambas as extremidades. D. Quando estas são cortadas com a EcoRI, são produzidas extremidades coesivas.

 

A amplificação do DNA doador dentro de uma célula bacteriana envolve

as etapas a seguir:

 

• Escolha de um vetor de clonagem e introdução do inserto (ver seção

antecedente para uma discussão sobre a última)

• Introdução da molécula de DNA recombinante em uma célula bacteriana • Recuperação das moléculas recombinantes amplificadas.

 

FIGURA 10.7 Adição de sítios de EcoRI às extremidades de moléculas de cDNA. As

moléculas de cDNA têm origem na última etapa na Figura 10.4. Adaptadores (regiões nos quadros) são adicionadas a ambas as extremidades das moléculas de cDNA. Esses adaptadores são oligonucleotídios bifilamentares que contêm um sítio de restrição (o sítio EcoRI está demonstrado em vermelho) e uma sequência de DNA aleatória em ambas as extremidades (representada por N).

 

FIGURA 10.8 A estratégia geral utilizada para clonar um gene. O tratamento com enzima de restrição do DNA doador e do vetor possibilita a inserção de fragmentos únicos nos vetores. Um vetor único entra em um hospedeiro bacteriano, no qual a replicação e a divisão celulares resultam em um grande número de cópias do fragmento doador.

 

Escolha dos vetores de clonagem. Os vetores devem ser moléculas pequenas para manipulação conveniente, mas podem variar de diversas formas para a adequação ao objetivo do experimento. Alguns vetores devem ser capazes de replicação prolífica em uma célula viva com a finalidade de amplificar o fragmento doador inserido. Contrariamente, outros são projetados para estarem presentes em apenas uma única cópia para manter a integridade do DNA inserido (ver adiante). Todos os vetores devem apresentar sítios de restrição convenientes, nos quais o DNA a ser clonado possa ser inserido (denominado um sítio poliligador ou de clonagem múltipla). Idealmente, o sítio de restrição deve estar presente apenas uma vez no vetor, tendo em vista que os fragmentos de restrição do DNA doador serão inseridos apenas naquela localização única no vetor. Também é importante ter um modo de identificar e recuperar rapidamente a molécula recombinante desejada. Diversos vetores de clonagem que atendem uma ampla diversidade de necessidades experimentais estão em uso atualmente. Em seguida estão algumas classes gerais de vetores de clonagem.

 

Vetores plasmidiais. Conforme descrito anteriormente, os plasmídios bacterianos são pequenas moléculas circulares de DNA que comumente replicam seu DNA independentemente do cromossomo bacteriano. Os plasmídios rotineiramente utilizados como vetores carregam um gene de resistência a fármacos e um gene para distinguir plasmídios com e sem insertos de DNA. Esses genes de resistência a fármacos proporcionam um modo conveniente de selecionar células bacterianas transformadas por plasmídios: aquelas células ainda vivas após a exposição ao fármaco devem carrear os vetores plasmidiais. Entretanto, nem todos os plasmídios nessas células transformadas conterão insertos de DNA. Alguns vetores plasmidiais também apresentam um sistema que possibilita que os pesquisadores identifiquem colônias bacterianas com plasmídios que contenham insertos de DNA. Por esse motivo, é desejável ser capaz de identificar colônias bacterianas com plasmídios que contenham insertos de DNA. Uma referida característica é parte do vetor plasmidial pUC18

demonstrado na Figura 10.9; os insertos de DNA rompem um gene (lacZ) no plasmídio que codifica uma enzima (β-galactosidase) necessária para clivar um composto adicionado ao ágar da placa de Petri (X-gal), de modo que ele produza um pigmento azul. Portanto, as colônias que contêm os plasmídios com o inserto de DNA serão brancas, em vez de azuis (elas não conseguem clivar o X-gal, tendo em vista que não produzem β-galactosidase).

 

Vetores bacteriófagos. Um vetor bacteriófago abriga DNA como um inserto “compactado” dentro da partícula do fago. Diferentes classes de vetores bacteriófagos podem carregar insertos de DNA doador de diferentes

tamanhos. O bacteriófago λ (lambda; discutido nos Capítulo 5 e 11) é um vetor de clonagem eficaz para insertos de DNA bifilamentares tão longos quanto 15 kb. A parte central do genoma do fago não é necessária para a replicação ou o acondicionamento de moléculas de DNA λ em E. coli e, assim, pode ser cortada por enzimas de restrição e descartada. A parte central deletada em seguida é substituída por insertos de DNA doador.

FIGURA 10.9 O vetor plasmidial pUC18 foi designado para a utilização como um vetor para a clonagem de DNA. A inserção de DNA em pUC18 é detectada por meio da inativação da função da β-galactosidase de lacZ, resultando em uma capacidade de converter o substrato artificial X-gal em um corante azul. O poliligador apresenta diversos sítios de restrição alternativos, dentro dos quais o DNA doador pode ser inserido. (Foto: Dr. James M. Burnette III e Dra. Leslie Bañuelos.)

 

Vetores para insertos de DNA maiores. Os vetores plasmidiais padrão e o fago λ já descritos podem aceitar DNA doador de tamanhos tão grandes quanto 10 a 15 kb. Entretanto, muitos experimentos necessitam de insertos que excedem em muito esse limite superior. Para atender a essas necessidades, foram construídos por engenharia genética vetores especiais que necessitam de métodos mais sofisticados para a transferência de DNA para a célula hospedeira. Em todos os casos, os DNA replicam como plasmídios grandes após terem sido introduzidos na bactéria.

Fosmídios são vetores que conseguem carrear insertos de 35 a 45 kb

(Figura 10.10). Eles são híbridos modificados de DNA de fago λ e DNA de

plasmídio F bacteriano (ver Capítulo 5). Os fosmídios são acondicionados nas partículas de fago λ, que atuam como as seringas que introduzem esses grandes pedaços de DNA recombinante dentro de células de E. coli receptoras. Após estarem na célula, esses híbridos, assim como o fago λ, formam moléculas circulares que replicam extracromossomicamente de modo semelhante aos plasmídios. Entretanto, em virtude da presença de origens de replicação do plasmídio F que acoplam a replicação do plasmídio à duplicação do cromossomo da célula hospedeira, muito poucas cópias de fosmídios se acumulam em uma célula.

O vetor mais popular para a clonagem de insertos de DNA muito grandes

em bactérias é o cromossomo artificial bacteriano (BAC). Derivado do plasmídio F, ele pode carregar insertos que variam de 100 a 200 kb, embora

o próprio vetor seja de apenas aproximadamente 7 kb (ver Figura 10.10). O DNA a ser clonado é inserido no plasmídio, e esse grande DNA recombinante circular é introduzido na bactéria. Os BAC foram os vetores “burros de carga” para a extensiva clonagem requerida por projetos de sequenciamento genômico em grande escala, incluindo o projeto público

para sequenciar o genoma humano (discutido no Capítulo 14).

 

CONCEITO-CHAVE O conjunto de ferramentas do engenheiro genético contém uma diversidade

de vetores de clonagem que aceitam insertos de tamanhos pequenos em plasmídios, de

tamanhos médios em bacteriófagos, e de tamanhos grandes em fosmídios e BAC.

 

Entrada das moléculas recombinantes na célula bacteriana. São utilizados três métodos para introduzir moléculas de DNA recombinante nas células

bacterianas: transformação, transdução e infecção (Figura 10.11; ver seções 5.3 e 5.4).

 

• Na transformação, as bactérias são banhadas em uma solução que contém

a molécula de DNA recombinante. Tendo em vista que as células

bacterianas utilizadas em pesquisas não conseguem captar moléculas de

DNA tão grandes quanto os plasmídios recombinantes, elas devem se

tornar competentes (ou seja, capazes de captar o DNA do meio

circundante) por meio da incubação em uma solução de cálcio ou da

exposição a um pulso elétrico de alta voltagem (eletroporação). Após a

entrada em uma célula competente através dos poros da membrana, a

molécula recombinante se torna um cromossomo de plasmídio (Figura

10.11 A). A eletroporação é o método de escolha para a introdução de

DNA especialmente grandes, tais como BAC, nas células bacterianas

FIGURA 10.10 Características de alguns vetores de clonagem de inserto grande. O número de clones necessário para abranger o genoma humano uma vez (1×) tem por base um tamanho de genoma de 3.000 Mb (3 bilhões de pares de bases).

 

FIGURA 10.11 O DNA recombinante pode ser inserido nas células bacterianas por meio de transformação, transdução, ou infecção com um fago. A. Vetores plasmidiais e BAC são inseridos por transformação mediada por DNA. B. Determinados vetores, tais como os fosmídios, são inseridos nas cabeças dos bacteriófagos (transdução); entretanto, após terem sido injetados na bactéria, eles formam círculos e são replicados como grandes plasmídios. C. Vetores bacteriófagos, tais como o fago λ, infectam e lisam a bactéria, liberando um clone de fagos como progênie, todos carregando a molécula de DNA recombinante idêntica no genoma do fago.

 

• Na transdução, a molécula recombinante é combinada com a cabeça do

fago e as proteínas da cauda para produzir um vírus que contém um DNA

amplamente não viral. Esses fagos modificados em seguida são

misturados com bactérias e injetam sua carga de DNA nas células

bacterianas, mas novos fagos não conseguem se formar, tendo em vista

que eles não carregam os genes virais necessários para a replicação dos

fagos. Os fosmídios são introduzidos dentro das células por meio de

transdução (Figura 10.11 B)

• Contrariamente à transdução, que produz plasmídios e colônias

bacterianas, mas não novos vírus, a infecção produz partículas de fagos

recombinantes (Figura 10.11 C). Por meio de rodadas repetidas de

reinfecção, uma placa repleta de partículas de fagos é formada a partir de

cada bactéria inicial que foi infectada. Cada partícula de fago em uma

placa contém não apenas o DNA recombinante, mas também os genes

virais necessários para criar novas partículas de fagos infecciosas.

 

Recuperação das moléculas recombinantes amplificadas. O DNA recombinante empacotado dentro das partículas de fagos é facilmente obtido por meio da coleta do lisado de fago e do isolamento do DNA que ele contém. Para obter o DNA recombinante acondicionado em plasmídios, fosmídios, ou BAC, as bactérias são quebradas química ou mecanicamente. O plasmídio de DNA recombinante é separado do cromossomo bacteriano principal muito maior por meio de centrifugação, eletroforese ou outras técnicas seletivas que distinguem o cromossomo do plasmídio pelo tamanho ou pela forma.