Introdução à Genética
Teste de flutuação de Luria e Delbrück
A origem da alteração hereditária espontânea sempre foi um tópico de interesse considerável. Entre as primeiras questões indagadas pelos geneticistas estava: “As mutações espontâneas ocorrem em resposta ao agente selecionado ou são variantes presentes a uma baixa frequência na maior parte das populações?” Um sistema experimental ideal para abordar essa questão importante foi a análise de mutações em bactérias que conferem resistência a agentes ambientais específicos normalmente não tolerados por células do tipo selvagem.
Um experimento de Salvador Luria e Max Delbrück, em 1943, foi
particularmente influente na moldagem da nossa compreensão sobre a natureza da mutação, não apenas em bactérias, mas nos organismos em geral. Naquela ocasião sabia-se que, se bactérias E. coli são espalhadas sobre uma placa de meio nutriente na presença do fago T1, os fagos logo infectam e matam as bactérias. Raramente, porém de modo regular, eram observadas colônias resistentes ao ataque de fagos; essas colônias eram estáveis e, assim, aparentavam ser mutantes genuínos. Entretanto, não se sabia se esses mutantes eram produzidos espontaneamente, porém de modo aleatório no tempo, ou se a presença do fago induzia uma alteração fisiológica que causava resistência.
Luria raciocinou que, se as mutações ocorriam espontaneamente, então
poderiam ocorrer em ocasiões diferentes em culturas diferentes. Nesse caso, o número de colônias resistentes por cultura deveria demonstrar alta variação (ou “flutuação”, em suas palavras). Posteriormente, ele alegou que a ideia passou por sua mente quando observou os retornos flutuantes obtidos por colegas que apostavam em um caça-níquel do baile de faculdade de um country club local; daí, a origem do termo mutação jackpot.
Luria e Delbrück projetaram seu “teste de flutuação” como se segue. Eles
inocularam 20 pequenas culturas, cada uma com algumas células, e as incubaram até que houvesse 108 células por mililitro. Ao mesmo tempo, também foi inoculada uma cultura muito maior e ela foi incubada até que houvesse 108 células por mililitro. As 20 culturas individuais e 20 amostras de mesmo tamanho da cultura grande foram plaqueadas na presença do fago. As 20 culturas individuais demonstraram alta variação no número de colônias resistentes: 11 placas apresentaram 0 colônia resistente e as remanescentes
apresentaram 1, 1, 3, 5, 5, 6, 35, 64 e 107 por placa (Figura 16.5 A). As 20 amostras da cultura grande demonstraram muito menos variação placa a placa, todas na faixa de 14 a 26. Se o fago estivesse induzindo mutações, não haveria motivo para a flutuação ser mais alta nas culturas individuais, tendo em vista que todas foram expostas ao fago de modo semelhante. A melhor explicação era que a mutação estava ocorrendo aleatoriamente no tempo: as mutações iniciais proporcionaram números mais altos de células resistentes, pois as células mutantes tiveram tempo para produzir muitos descendentes resistentes. As
últimas mutações produziram menos células resistentes (Figura 16.5 B). Esse resultado levou ao “paradigma” da mutação; isso é, seja em vírus, bactérias ou eucariotos, podem ocorrer mutações em qualquer célula em qualquer ocasião e a sua ocorrência é aleatória. Por esse e por outro trabalho, Luria e Delbrück receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1969. Curiosamente, isso ocorreu após o primeiro aluno de pós-graduação de Luria, James Watson, ter recebido o seu Prêmio Nobel (com Francis Crick em 1964) pela descoberta da estrutura de dupla-hélice do DNA.
FIGURA 16.5 Estes heredogramas celulares ilustram as expectativas de duas hipóteses contrastantes a respeito da origem de células resistentes.
Essa análise elegante sugere que as células resistentes são selecionadas pelo
agente ambiental (aqui, o fago), em vez de produzidas por ele. A existência de mutantes em uma população pode ser demonstrada diretamente antes da seleção? Essa demonstração foi possibilitada por meio da utilização de uma técnica denominada plaqueamento em réplica, desenvolvida em grande parte por Esther Lederberg em 1952. Uma população de bactérias foi plaqueada em meio não seletivo – ou seja, um meio não contendo fagos – e cresceu uma colônia a partir de cada célula. Essa placa foi denominada placa máster. Um pedaço de veludo estéril foi pressionado levemente sobre a superfície da placa máster e o veludo coletou células em todos os locais onde havia uma colônia
(Figura 16.6). Desse modo, o veludo coletou uma “impressão” das colônias da placa inteira. Em seguida, placas-réplica contendo meio seletivo (ou seja, contendo o fago T1) foram tocadas com o veludo. Ao toque das placas com o veludo, as células contidas nele foram inoculadas nas placas-réplica nas mesmas posições relativas daquelas das colônias na placa máster original. Conforme esperado, foram observadas colônias mutantes resistentes raras nas placas-réplica, mas as múltiplas placas-réplica demonstraram padrões idênticos de