Introdução à Genética
4.4 Mapeamento de centrômeros com tétrades lineares
FIGURA 4.14 Um padrão de bandeamento de PCR é demonstrado em relação a uma família com seis filhos. Tal padrão está interpretado na parte superior da ilustração com a utilização de quatro “alelos” microssatélites de tamanhos diferentes, M' a M''. Um desses marcadores (M”) provavelmente está ligado em configuração cis ao alelo P da doença. (Nota: este não é um cruzamento-teste, ainda que seja informativo a respeito da ligação.)
A Figura 4.15 contém alguns dados reais que demonstram como os marcadores
moleculares podem contribuir para o mapa de um cromossomo humano. Você pode observar que o número de marcadores moleculares mapeados excede em muito o número de genes mapeados com fenótipos mutantes. Observe que os SNP, em virtude de sua densidade ainda mais alta, não podem ser representados em um mapa
de cromossomo inteiro, tal como aquele na Figura 4.15, uma vez que haveria milhares deles. Um centimorgan (1 u.m.) do DNA humano é um segmento enorme, estimado como 1 megabase (1 Mb = 1 milhão de pares de bases, ou 1.000 kb). Portanto, você pode verificar a necessidade de marcadores moleculares próximos para uma análise meticulosa de distâncias menores. Observe que o DNA equivalente a 1 u.m. varia muito entre as espécies; por exemplo, no parasita da malária, Plasmodium falciparum, 1 u.m. = 17 kb.
CONCEITO-CHAVE Os loci de qualquer heterozigosidade do DNA podem ser mapeados e utilizados como
marcadores cromossômicos moleculares ou marcos.
4.4 Mapeamento de centrômeros com tétrades
lineares Centrômeros não são genes, mas regiões do DNA das quais a reprodução ordenada dos organismos vivos depende totalmente e, portanto, são de grande interesse em genética. Na maior parte dos eucariotos, a análise de recombinação não pode ser utilizada para mapear os loci dos centrômeros, tendo em vista que eles não demonstram heterozigosidade que lhes possibilite serem utilizados como
marcadores. Entretanto, nos fungos que produzem tétrades lineares (ver Capítulo 3), os centrômeros podem ser mapeados. Utilizaremos o fungo Neurospora como um exemplo. Relembre que, em fungos haploides, tais como Neurospora, os núcleos haploides de cada genitor se fundem para formar um diploide temporário, que é submetido a divisões meióticas ao longo do eixo longitudinal do asco e, assim, cada meiócito produz um arranjo linear de oito ascósporos, denominado óctade. Esses oito ascósporos constituem os quatro produtos da meiose (uma tétrade), mais uma mitose pós-meiótica.
FIGURA 4.15 O diagrama demonstra a distribuição de todas as diferenças genéticas que haviam sido mapeadas no cromossomo 1 na ocasião em que este diagrama foi desenhado. Alguns marcadores são genes de fenótipos conhecidos (seus números estão sombreados em verde), mas a maior parte é de marcadores de DNA polimórficos (os números sombreados em malva e azul representam duas classes diferentes de marcadores moleculares). Um mapa de ligação que ilustra um conjunto bem-espaçado destes marcadores, com base nas análises da frequência de recombinantes do tipo descrito neste capítulo, está no centro da ilustração. As distâncias de mapa estão demonstradas em centimorgans (cM). Com um comprimento total de 356 cM, o cromossomo 1 é o mais longo dos cromossomos humanos. Também foram localizados alguns marcadores no mapa citogenético do cromossomo 1 (mapa à direita, denominado um idiograma), por meio da utilização das técnicas descritas posteriormente neste capítulo. A existência de marcadores em comum nos diferentes mapas genéticos possibilita que as localizações de outros genes e marcadores moleculares sejam estimadas em cada mapa. (Dados de B. R. Jasny et al., Science, 30 de setembro de 1994.)
Em sua forma mais simples, o mapeamento do centrômero considera um locus
gênico e indaga quão distante esse locus está do centrômero. O método tem por base o fato de que um padrão diferente de alelos aparecerá em uma tétrade linear ou uma óctade que tenha se originado de uma meiose com um crossover entre um gene e seu centrômero. Considere um cruzamento entre dois indivíduos, cada um deles apresentando um alelo diferente em um locus (digamos, A × a). A lei da segregação igual de Mendel dita que, em uma óctade, sempre haverá quatro ascósporos do genótipo A e quatro do genótipo a, mas como eles estarão dispostos? Se não houve crossover na região entre A/a e o centrômero, haverá dois blocos adjacentes de
quatro ascósporos na óctade linear (ver Figura 3.10, no Capítulo 3). Entretanto, se houve um crossover naquela região, haverá um de quatro padrões diferentes na óctade, cada um dos padrões demonstrando blocos de dois alelos idênticos adjacentes. Alguns dados de um cruzamento real de A × a estão demonstrados na tabela a seguir:
Óctades
A a A a A a
A a A a A a
A a a A a A
A a a A a A
a A A a a A
a A A a a A
a A a A A a
a A a A A a
126 132 9 11 10 12
Total = 300
As primeiras duas colunas à esquerda são de meioses sem crossover na região entre o locus A e o centrômero. A letra M é utilizada para fazer referência a um tipo de segregação na meiose. Os padrões em relação às primeiras duas colunas são denominados padrões de MI, ou padrões de segregação de primeira divisão, tendo em vista que os dois alelos diferentes segregam para dois núcleos-filhos na primeira divisão da meiose. As outras quatro colunas são todas de meiócitos com um crossover. Esses padrões são denominados padrões de segregação de segunda divisão (M II) tendo em vista que, como um resultado do crossover na região entre o centrômero e o locus, os alelos A e a ainda estão juntos nos núcleos ao término da
primeira divisão da meiose (Figura 4.16). Não houve segregação na primeira divisão. Entretanto, a segunda divisão meiótica segrega os alelos A e a em núcleos separados. Os outros padrões são produzidos de modo semelhante; a diferença é que
as cromátides se movimentam em direções diferentes na segunda divisão (Figura
4.17).
Você pode observar que a frequência de óctades com um padrão de MII deve ser
proporcional ao tamanho da região do centrômero até A/a e pode ser utilizada como uma medida do tamanho daquela região. Em nosso exemplo, a frequência de MII é 42/300 = 14%. Essa porcentagem significa que o locus A/a está a 14 u.m. do centrômero? A resposta é não, mas esse valor poderia ser utilizado para calcular o número de unidades de mapa. O valor de 14% é uma porcentagem da meiose, que não é o modo como as unidades de mapa são definidas. As unidades de mapa são definidas como a porcentagem de cromátides recombinantes oriundas da meiose. Tendo em vista que um crossover em qualquer meiose resulta em apenas 50% de
cromátides recombinantes (quatro entre oito; ver Figura 4.17), é preciso dividir os 14% por 2 para converter a frequência de MII (uma frequência de meiose) em unidades de mapa (uma frequência de cromátides recombinantes). Portanto, essa região tem obrigatoriamente um comprimento de 7 u.m. e essa medida pode ser introduzida no mapa daquele cromossomo.
FIGURA 4.16 A e a segregam-se em núcleos separados na segunda divisão meiótica quando existe um crossover entre o centrômero e o locus A.