12.7 Repressão gênica pós-transcricional pelos miRNA

Um modelo interessante em relação ao modo como a transcrição de um

ncRNA pode influenciar a estrutura da cromatina no Xi está demonstrado

na Figura 12.30. De acordo com esse modelo, na medida em que um ncRNA é transcrito pela RNA pol II, proteínas se ligam especificamente às suas sequências e catalisam as modificações de histona que iniciam a formação de heterocromatina. Desse modo, os ncRNA atuam como amarras para recrutar proteínas modificadoras da cromatina para o cromossomo X a partir do qual ele é transcrito.

 

CONCEITO-CHAVE Em relação à maior parte dos organismos diploides, ambos os alelos de um

gene são expressos de modo independente. O imprinting genômico e a inativação do X são

exemplos de expressão monoalélica. Nesses casos, mecanismos epigenéticos silenciam um

único locus cromossômico ou uma cópia de um cromossomo inteiro, respectivamente.

 

12.7 Repressão gênica pós-transcricional pelos

miRNA

O Xist é um exemplo da classe em rápido crescimento de RNA funcionais

(ver Capítulo 8). Os RNA funcionais não codificam proteínas; em vez disso, realizam uma diversidade de tarefas que exploram a complementaridade do RNA-RNA e do RNA-DNA. Os RNA funcionais discutidos aqui contêm sequências específicas que direcionam as proteínas ou os complexos proteicos para locais na célula onde seus serviços são necessários. Por exemplo, o Xist atua para direcionar proteínas envolvidas na formação da heterocromatina para um dos dois cromossomos X.

FIGURA 12.30 Um modelo que demonstra como o RNA Xist pode atuar em cis para ligar proteínas que inativam um cromossomo X por meio da formação de heterocromatina.

 

 

Dois tipos de pequenos RNA funcionais foram introduzidos no Capítulo

8: os siRNA e os miRNA. Nesta seção, exploramos como os miRNA auxiliam na regulação da expressão gênica eucariótica. A função dos

siRNA será considerada adicionalmente no Capítulo 15.

Lembre, do Capítulo 8, que os miRNA são sintetizados pela RNA pol II

como RNA mais longos que são processados nos miRNA biologicamente

ativos menores (aproximadamente 22 nt) (ver Figura 8.20). Os organismos contêm centenas de miRNA que regulam milhares de genes. Desses, aproximadamente 1/3 está organizado em grupos que são transcritos em um único transcrito, que posteriormente é processado para formar diversos miRNA. Contrariamente, aproximadamente 1/4 de todos os miRNA é processado a partir de transcritos derivados de íntrons recompostos. As etapas finais no processamento dos miRNA ocorrem no citoplasma.

No Capítulo 8, vimos como os miRNA de filamento único ativos se

ligam ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) e hibridizam com mRNA complementares aos miRNA. Especificamente, a região de ligação do miRNA é composta pelos nucleotídios 2 a 8 do miRNA de aproximadamente 22 nt, denominada região semente. Os nucleotídios da região semente se ligam à 3′UTR de um mRNA que está

sendo traduzido pelos ribossomos (Figura 12.31). Embora se saiba que o complexo miRNA-RISC inibe a tradução, o mecanismo preciso ainda está sob investigação. Modelos em relação a como a tradução pode ser reprimida incluem a interferência no início da tradução ou alongamento ou

a remoção da cauda poli(A), que aceleraria a degradação do mRNA (Figura

12.31).

Embora os miRNA tenham sido descobertos há cerca de 20 anos, os

cientistas estão apenas começando a decifrar a extensão e a complexidade do controle da expressão gênica eucariótica pelos miRNA. Considere que, em mamíferos, sequências complementares às regiões semente dos miRNA são encontradas na 3′UTR de diversas centenas de genes. Além disso, as 3′UTR de alguns genes contêm sequências complementares a diversos miRNA, enquanto muitos miRNA contêm sequências complementares às 3′UTR de diversos genes. Portanto, um gene possivelmente pode ser reprimido por diversos miRNA (seja individualmente ou em combinação) e um miRNA possivelmente pode reprimir a tradução de diversos genes. No

Capítulo 11, você viu que a organização de genes bacterianos em óperons possibilitou a regulação coordenada de genes que contribuíram para um traço único, tal como a capacidade de utilizar o açúcar lactose. Tendo em vista que a maior parte dos genes eucarióticos não está organizada em óperons, foi sugerido que a regulação pós-transcricional de diversos genes por um miRNA possibilita aos organismos superiores a capacidade de coordenar a expressão dos seus genes.

FIGURA 12.31 Ver o texto para detalhes.

 

RESUMO

 

Muitos aspectos da regulação gênica eucariótica se assemelham à regulação dos óperons bacterianos. Ambas operam amplamente no nível da transcrição e ambas dependem de proteínas transatuantes que se ligam às sequências-alvo reguladoras de ação cis na molécula de DNA. Essas proteínas reguladoras determinam o nível de transcrição de um gene ao controlar a ligação da RNA polimerase ao promotor gênico.

Existem três características de distinção importantes do controle da

transcrição em eucariotos. Primeiramente, os genes eucarióticos apresentam acentuadores, que são elementos reguladores de ação cis localizados por vezes a grandes distâncias lineares do promotor. Muitos genes apresentam múltiplos acentuadores. Em segundo lugar, esses acentuadores com frequência são ligados por mais fatores de transcrição do que os óperons bacterianos. Eucariotos multicelulares devem gerar milhares de padrões de expressão gênica com um número limitado de proteínas reguladoras (fatores de transcrição). Eles realizam isso por meio de interações combinatórias de fatores de transcrição. Os acentuassomos são complexos de proteínas reguladoras que interagem de modo cooperativo e sinérgico para promover altos níveis de transcrição por meio do recrutamento da RNA polimerase II para o sítio de início da transcrição.

Em terceiro lugar, os genes eucarióticos estão compactados na cromatina.

A ativação e a repressão dos genes necessitam de modificações específicas na cromatina. A vasta maioria dos milhares de genes em um genoma eucariótico típico está desligada em qualquer ocasião. Os genes são mantidos em um estado transcricionalmente inativo por meio da participação dos nucleossomos, que atuam para compactar a cromatina e prevenir a ligação da RNA polimerase II. A posição dos nucleossomos e a extensão da condensação da cromatina são determinadas pelo padrão de modificações pós-tradução das caudas de histonas. As modificações das histonas são marcas epigenéticas que, juntamente com a metilação das bases citosina, podem ser alteradas por fatores de transcrição. Esses fatores se ligam às regiões reguladoras e recrutam complexos proteicos que modificam enzimaticamente os nucleossomos adjacentes. Esses grandes complexos proteicos multissubunitários utilizam a energia da hidrólise de ATP para movimentar os nucleossomos e remodelar a cromatina.

A replicação do DNA copia fielmente ambas a sequência do DNA e a

estrutura da cromatina da célula genitora para as células-filhas. Células recém-formadas herdam tanto a informação genética, inerente à sequência de nucleotídios do DNA, quanto a informação epigenética, que está no código de histonas e no padrão de metilação do DNA.

A existência de fenômenos epigenéticos, tais como o imprinting genético

e a inativação do cromossomo X, demonstra que a expressão gênica eucariótica pode ser silenciada sem a alteração da sequência de DNA do gene. Outro fenômeno epigenético, a variegação por efeito de posição, revelou a existência de domínios heterocromáticos repressivos que estão associados a nucleossomos altamente condensados e que contêm poucos genes. Isoladores de barreira mantêm a integridade do genoma ao evitar a conversão da eucromatina em heterocromatina.

Existe uma crescente apreciação em relação ao papel dos RNA

funcionais, tais como os ncRNA e os miRNA, na regulação da expressão gênica eucariótica. Esses RNA direcionam complexos proteicos para o DNA complementar ou o RNA na célula. Em relação a alguns RNA (como o Xist), o ato de transcrição pode fixar o RNA a uma região cromossômica na qual proteínas se ligarão e alterarão a cromatina. Contrariamente, a tradução de centenas de mRNA é reprimida quando RISC ligado a miRNA complementares é direcionado às regiões 3′UTR dos mRNA.

 

TERMOS-CHAVE

 

acentuador

acentuassomo

cauda de histonas

coativador

código de histonas

compensação de dose

complexo mediador

corpúsculo de Barr

correpressor

domínio de ativação

efeito sinérgico

elemento proximal do promotor

eucromatina

gene repórter

hemimetilação

herança epigenética

heterocromatina

heterocromatina constitutiva

hiperacetilação

hipoacetilação

histona desacetilase (HDAC)

ilhota de CpG

imprinting genômico

imprinting materno

imprinting paterno

isolador de barreira

isolador de bloqueio de acentuador

marca epigenética

modificação das histonas

modificação pós-tradução (PTM)

remodelagem da cromatina

sequência de ativação upstream (UAS)

silenciamento gênico pós-transcricional

silenciamento gênico transcricional

variante de histonas

variegação por efeito de posição (PEV)

 

PROBLEMAS

QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS

1. Na Figura 12.4, determinadas mutações diminuem a taxa de

transcrição relativa do gene da β-globina. Onde essas mutações estão localizadas e como elas exercem seus efeitos sobre a transcrição?

2. Com base nas informações na Figura 12.6, como Gal4 regula quatro

genes GAL diferentes ao mesmo tempo? Contraste esse mecanismo com o modo como o repressor Lac controla a expressão de três genes.

3. Em qualquer experimento, controles são essenciais para determinar o

efeito específico da alteração de algum parâmetro. Na Figura 12.7, quais construtos são os “controles” que atuam para estabelecer o princípio de que os domínios de ativação são modulares e intercambiáveis?

4. Contraste o papel da proteína MCM1 nos diferentes tipos celulares de

levedura demonstrados na Figura 12.10. Como os genes a-específicos são diferentemente controlados em tipos celulares diferentes?

5. Na Figura 12.11 B, em qual região cromossômica você

provavelmente encontra a maior parte da proteína histona H1?

6. Qual é a conexão conceitual entre as Figuras 12.12 e 12.19?

7. Na Figura 12.19, onde o TATA boxe está localizado antes da

formação do acentuassomo na parte superior da figura?

8. Digamos que você apresenta habilidades incríveis e consegue isolar

as manchas brancas e vermelhas de tecido dos olhos de Drosophila

demonstradas na Figura 12.24 com a finalidade de isolar o mRNA de cada preparação tecidual. Utilizando o seu conhecimento sobre as

técnicas de DNA do Capítulo 10, desenhe um experimento que possibilitaria a você determinar se o RNA é transcrito a partir do gene branco no tecido vermelho ou no tecido branco ou ambos. Se for necessário, você tem acesso ao DNA radioativo do gene branco.

Na Figura 12.26, forneça um mecanismo bioquímico pelo qual a HP-

9. 1 consegue se ligar ao DNA apenas do lado esquerdo do isolador de

barreira. De modo semelhante, por que a HMTase consegue se ligar apenas ao DNA à esquerda do isolador de barreira?

10. Em referência à Figura 12.28, desenhe o desfecho se houver uma

mutação no gene B.

 

PROBLEMAS BÁSICOS

11. Quais analogias você consegue traçar entre os fatores de transcrição

transatuantes que ativam a expressão gênica em eucariotos e os fatores correspondentes em bactérias? Forneça um exemplo.

12. Contraste como os estados fundamentais dos genes no DNA de

bactérias e eucariotos diferem em relação à ativação gênica (ver

Figura 12.2).

13. Preveja e explique o efeito sobre a transcrição de GAL1, na presença

somente de galactose, das mutações a seguir:

a. Deleção de um sítio de ligação de Gal4 no elemento UAS GAL1. b. Deleção de todos os quatro sítios de ligação de Gal4 no elemento UAS GAL1.

c. Deleção do sítio de ligação Mig1 upstream de GAL1. d. Deleção do domínio de ativação Gal4. e. Deleção do gene GAL80. f. Deleção do promotor GAL1. g. Deleção do gene GAL3.

14. Como a ativação do gene GAL1 é evitada na presença de galactose e

glicose?

15. Quais são os papéis da desacetilação e da acetilação de histonas na

regulação gênica, respectivamente?

16. Uma linhagem α de levedura que não consegue realizar a alteração do

tipo reprodutivo é isolada. Quais mutações ela pode carregar que expliquem esse fenótipo?

17. Quais genes são regulados pelas proteínas α1 e α2 em uma célula α?

18. O que são as proteínas Sir? Como as mutações nos genes SIR afetam

a expressão dos cassetes de tipo reprodutivo?

19. Qual é o significado do termo herança epigenética? Cite dois

exemplos de tal herança?

20. O que é um acentuassomo? Por que uma mutação em qualquer uma

das proteínas do acentuassomo poderia reduzir drasticamente a taxa de transcrição?

21. Normalmente, a deleção de um gene resulta em uma mutação

recessiva. Explique como a deleção de um gene imprintado pode ser uma mutação dominante.

22. O que é necessário ocorrer para que a expressão de dois genes

diferentes em dois cromossomos diferentes seja regulada pelo mesmo miRNA?

23. Quais mecanismos se acredita serem responsáveis pela herança da

informação epigenética?

24. Qual a diferença fundamental no modo como os genes bacterianos e

eucarióticos são regulados?

25. Por que se diz que a regulação da transcrição em eucariotos é

caracterizada por interações combinatórias?

26. Qual das declarações a seguir a respeito das histonas é verdadeira?

a. Elas são proteínas cuja sequência é altamente conservada em todos os eucariotos.

b. Elas são os blocos de construção dos nucleossomos. c. a e b estão corretas.

d. Nenhuma das anteriores está correta.

27. Os nucleossomos são:

a. compostos por DNA e proteína. b. necessários para condensar o DNA/os cromossomos. c. essenciais para a correta regulação da expressão gênica eucariótica. d. Todas as anteriores são verdadeiras.

28. As regiões cromossômicas que formam a heterocromatina:

a. contêm genes altamente expressos. b. contêm poucos genes.

c. estão associadas à membrana nuclear. d. são abundantes em procariotos.

29. A compensação de dose é necessária porque:

a. algumas regiões do genoma contêm mais genes do que outras. b. os genes próximos da heterocromatina tendem a ser silenciados. c. os acentuadores podem ativar a transcrição, estejam eles upstream ou downstream de um gene. d. os genes no cromossomo X apresentam o dobro de cópias nas fêmeas do que nos machos.

30. Qual das seguintes é verdadeira a respeito da cromatina em

procariotos?

a. Os cromossomos bacterianos não estão organizados em cromatina. b. Está localizada no núcleo. c. Está localizada no citoplasma. d. É muito semelhante à cromatina em eucariotos.

31. Qual(is) das declarações a seguir é(são) verdadeira(s) sobre o

fenótipo da cor de olhos variegada na Figura 12.23? a. O gene branco está ativo nos setores brancos e inativo nos setores vermelhos.

b. O gene branco está inativo nos setores brancos e ativo nos setores vermelhos.

c. O gene branco está inativo nos setores brancos em virtude da difusão da heterocromatina.

d. b e c são, ambas, verdadeiras.

32. Quais dos seguintes são marcas epigenéticas?

a. Aminoácidos básicos metilados nas caudas de histonas. b. Resíduos de citosina metilados no DNA. c. Aminoácidos acetilados nas caudas de histonas. d. Todas as anteriores são marcas epigenéticas.

 

PROBLEMAS DESAFIADORES

33. A transcrição de um gene denominado YFG (your favorite gene) é

ativada quando três fatores de transcrição (TFA, TFB, TFC) interagem para recrutar o coativador CRX. TFA, TFB, TFC e CRX e seus respectivos sítios de ligação constituem um acentuassomo localizado a 10 kb do local de início da transcrição. Desenhe um diagrama demonstrando como você acredita que o acentuassomo atue para recrutar a RNA polimerase para o promotor de YFG.

34. Uma única mutação em um dos fatores de transcrição no Problema 33

resulta em uma redução drástica na transcrição de YFG. Diagrame a representação dessa interação mutante.

35. Diagrame o efeito de uma mutação no sítio de ligação para um dos

fatores de transcrição no Problema 33.

36. Alelos nulos (genes mutantes) não produzem produto proteico. Essa é

uma alteração genética. Entretanto, genes epigeneticamente silenciados também não produzem produto proteico. Como se determina experimentalmente se um gene foi silenciado por mutação ou se foi silenciado epigeneticamente?

O que são marcas epigenéticas? Quais estão associadas à

37.

heterocromatina? Como se acredita que as marcas epigenéticas sejam responsáveis pela determinação da estrutura da cromatina?

38. Você recebe quatro linhagens de leveduras pelo correio e as

instruções de acompanhamento declaram que cada linhagem contém uma única cópia do transgene A. Você cultiva as quatro linhagens e determina que apenas três linhagens expressam o produto proteico do transgene A. Análise adicional revela que o transgene A está localizado em uma posição diferente no genoma de levedura em cada uma das quatro linhagens. Forneça uma hipótese para explicar esse resultado.

39. Você deseja encontrar os elementos reguladores de ação cis do DNA

responsáveis pelas respostas de transcrição de dois genes, c-fos e globina. A transcrição do gene c-fos é ativada em resposta ao fator de crescimento de fibroblasto (FGF), mas é inibida pelo cortisol (Cort). Por outro lado, a transcrição do gene globina não é afetada pelo FGF ou pelo cortisol, mas é estimulada pelo hormônio eritropoetina (EP). Para encontrar os elementos reguladores do DNA de ação cis responsáveis por essas respostas transcricionais, você utiliza os clones a seguir dos genes c-fos e globina, bem como duas combinações “híbridas” (genes de fusão), conforme demonstrado no diagrama a seguir. A letra A representa o gene c-fos intacto, D representa o gene globina intacto e B e C representam fusões dos genes c-fos e globina. Os éxons (E) e os íntrons (I) de c-fos e globina estão numerados. Por exemplo, E3(f) é o terceiro éxon do gene c-fos e I2(g) é o segundo íntron do gene globina. (Esses rótulos são fornecidos para ajudar a tornar a sua resposta clara.) Os sítios de início da transcrição (setas pretas) e os sítios de poliadenilação (setas vermelhas) estão indicados.

Você introduz todos os quatro clones simultaneamente em células de cultura de tecido e em seguida estimula alíquotas individuais dessas células com um dos três fatores. A análise em gel do RNA isolado a partir das células fornece os resultados a seguir:

 

 

Os níveis de transcritos produzidos pelos genes introduzidos em resposta a diversos tratamentos estão demonstrados; a intensidade dessas bandas é proporcional à quantidade de transcritos produzidos a partir de um clone em particular. (A falha na visualização de uma banda indica que o nível de transcrito é indetectável.) a. Onde está o elemento de DNA que possibilita a ativação por FGF? b. Onde está o elemento de DNA que possibilita a repressão por Cort?

c. Onde está o elemento de DNA que possibilita a indução por EP? Explique a sua resposta.

40. Com a utilização do sistema experimental demonstrado na Figura

12.26, um geneticista é capaz de inserir um isolador de barreira entre o gene white e a heterocromatina. O fenótipo do olho de Drosophila transgênica mais provavelmente seria:

a. todo branco, tendo em vista que o elemento de barreira evitará a difusão da heterocromatina.

b. todo vermelho, tendo em vista que o elemento de barreira evitará a difusão da heterocromatina.

c. ainda variegado, tendo em vista que os elementos de barreira não interrompem a difusão da heterocromatina.

d. ainda variegado, tendo em vista que os elementos de barreira não atuam em Drosophila.

41. Qual dos seguintes é um exemplo de repressão gênica pós-

transcricional?

a. A quantidade de RNA transcrito a partir de um gene é reduzida em virtude da metilação do DNA.

b. A quantidade de RNA é reduzida em virtude de sua rápida degradação.

c. A quantidade de proteína produzida é reduzida por meio da ação de um miRNA.

d. As alternativas b e c estão ambas corretas.

 

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