Virologia
Cultura celular/isolamento do vírus
FIG. 2 Fotografias de microscopia eletrônica de a, adenovírus; b, astrovírus; c, parvovírus e d, um poxvírus. (As fotografias são uma cortesia do Prof. M. Taylor, Pretoria University.)
Essa é uma abordagem abrangente, mas apresenta uma sensibilidade
limitada, requerendo aproximadamente 106 partículas virais/ml de fluido para permitir a visualização e a identificação corretas. A microscopia eletrônica não pode fazer a diferenciação entre vírus da mesma família, por exemplo, o vírus do herpes simples (HSV) e o VZV, a não ser que sejam feitos mais testes na amostra, por exemplo, a imunomicroscopia eletrônica em fase sólida (SPIEM).
Cultura celular/isolamento do vírus
A propagação dos vírus in vitro pode utilizar ovos embrionados ou animais de laboratório; atualmente, as culturas de células são o meio preferido. O isolamento dos vírus está relegado a alguns laboratórios de referência.
Existem muitos tipos diferentes de cultura de células, pois não existe
nenhuma linhagem celular que suporte o crescimento de todos os vírus
importantes (Tabela 1). Os diversos tipos celulares podem ser classificados em três grupos: células de linhagem primária, secundária e contínua.
Tabela 1
Vantagens e desvantagens da cultura de células
Vantagens Desvantagens
Detecta vírus infecciosos Trabalhosa “Abrangente” Diversos vírus não são cultiváveis Pode-se estudar mais o que for isolado Requer pessoal técnico qualificado São detectadas infecções duplas/mistas Requer várias linhagens de células Baixo custo Requer muito espaço
As células de linhagem primária são preparadas diretamente do tecido,
geralmente um animal ou embrião. As células primárias podem ser passadas (ou seja, algumas células são transferidas para um novo recipiente, permitindo que se multipliquem) só por algumas gerações antes de morrerem.
As células de linhagem secundária ou finita também são conhecidas
como diplóides, podendo ser transferidas por 40 a 60 passagens.
As células da linhagem contínua são células transformadas que foram
“imortalizadas”, podendo ser mantidas indefinidamente. A maioria das culturas é incubada a 35 a 37° C, apesar de temperaturas mais baixas (33° C) serem usadas para determinar a presença de vírus respiratórios em culturas de células. O principal método usado para diagnosticar a presença de vírus em cultura celular é detectando-se, à microscopia óptica, alterações
na estrutura celular, conhecidas com efeito citopático (CPE) (Fig. 3a e b).
FIG. 3 Cultivo de CMV em fibroblastos. A, Efeito citopático (CPE). B, Monocamada de fibroblastos não infectados. C, Teste DEAFF – Coloração imunofluorescente de fibroblastos infectados por citomegalovírus.
A hemadsorção é um método utilizado para reduzir o tempo que se leva
para detectar um vírus multiplicando em uma cultura. Estruturas glicoproteicas, chamadas de hemaglutininas, presentes na superfície de alguns vírus, por exemplo, os vírus da influenza e parainfluenza, induzem a adsorção dos eritrócitos à superfície celular. A presença de hemadsorção pode ser detectada dias antes do CPE.
Alguns vírus, como o vírus da rubéola, multiplicam-se em cultura sem
produzir CPE. Para alguns desses vírus, a detecção baseia-se no fenômeno da “interferência”. Por exemplo, quando o vírus da rubéola cresce em células primárias de rim de macaco, essas células se tornam resistentes à infecção pelo echovírus. Uma vez que um vírus causador da interferência, como o vírus da rubéola, tenha se multiplicado em uma cultura, pode-se utilizar a reação de neutralização ou a marcação das proteínas virais com um anticorpo fluorescente para identificar o vírus.
A cultura sobre lamínulas de vidro ou em placas (shell vial) combina a
cultura celular com métodos de detecção de antígeno, sendo um meio rápido de detecção viral. As amostras são inoculadas em fibroblastos previamente cultivados sobre uma lamínula. Após a incubação, o material é submetido à reação de imunofluorescência usando-se anticorpo monoclonal.
A cultura de vírus ainda desempenha um papel crucial na determinação
da resistência dos vírus a agentes antivirais, chamada de resistência fenotípica. Ela é particularmente útil quando os padrões de resistência genotípica não são bem conhecidos, por exemplo, o citomegalovírus (CMV). Historicamente, os vírus eram propagados em animais de laboratório e ovos embrionados. Os histopatologistas usam um microscópio óptico, ou até mesmo um microscópio eletrônico, para visualizar os efeitos da infecção viral na morfologia do tecido. As células ou tecido infectado são submetidos a ensaios imuno-histoquímicos usando anticorpos monoclonais marcados para detectar os antígenos virais no tecido doente.