Virologia
Capítulo 14: O diagnóstico laboratorial das infecções virais – detecção do ácido nucleico viral
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O diagnóstico laboratorial das
infecções virais – detecção do ácido
nucleico viral
A detecção do genoma viral, ou seja, o ácido nucleico é uma ferramenta
poderosa. Em alguns casos, como na hepatite B crônica com atividade de multiplicação viral elevada, infecção aguda pelo parvovírus B19 e a diarreia aguda pelo rotavírus, os títulos virais são altos e, portanto, existe genoma viral suficiente nas amostras clínicas para ser detectado e caracterizado sem essa ferramenta. Entretanto, o verdadeiro avanço só ocorreu com o advento das técnicas de amplificação do ácido nucleico que permitem o aumento seletivo da concentração do ácido nucleico antes de sua detecção.
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é o método mais comum (Fig.
1). Como o nome sugere, é uma reação cíclica com 30 a 40 ciclos que consistem em desnaturação (separação) da dupla hélice de DNA a 90 a 95° C, anelamento dos primers a 50 a 60° C e extensão dos primers a 70 a 72° C, seguida de desnaturação da dupla hélice de DNA recém-formada, recomeçando a sequência. Se o ácido nucleico viral detectado for o RNA, a reação é precedida por uma reação de transcrição reversa (RT-PCR).
FIG. 1 O princípio da reação em cadeia da polimerase.
O pré-requisito da reação consiste na utilização de uma enzima
polimerase termoestável que resista às altas temperaturas. Também é necessário o conhecimento da sequência de bases da molécula-alvo, pois são utilizados primers específicos complementares a regiões genômicas do alvo. No final, a sequência-alvo (produto) foi amplificada tremendamente (a princípio, de 2número de ciclos), sendo identificada pelo seu tamanho, por eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etídio e visualizada sob
luz UV (Fig. 2), ou, mais especificamente, usando sondas marcadas. Isso é feito na forma de PCR em tempo real em que a amplificação e a detecção (quantitativa), usando-se uma sonda específica, ocorrem simultaneamente
(Fig. 3).
FIG. 2 Eletroforese em gel de agarose mostrando cinco amostras (1 → 5), reagente em branco (B), controle positivo (+), controle negativo (–) e um marcador de peso molecular do DNA.
FIG. 3 Curvas de amplificação de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.
Existem vários métodos semelhantes para a amplificação seletiva de
sequências-alvo, como a reação em cadeia da ligase (LCR), amplificação baseada em sequências de ácidos nucleicos (NASBA), amplificação de sinal de DNA ramificado (bDNA, branched DNA amplification) e captura híbrida.