6.7 Separações instrumentais

automáticas foram desenvolvidas, principalmente para aplicações

biológicas, que podem trabalhar com volumes de até 1000 ml por amostra.

Como a água é removida em temperaturas moderadamente baixas,

espera-se que a amostra seja menos alterada do que nas destilações

convencionais e, como a operação é feita no vácuo, com menor

contaminação. A matriz remanescente ao final do processo, que comumente

se resume a uma pequena porção de pó seco, é geralmente bastante estável

e, por isso, a técnica é conveniente para processar amostras que não podem

ser analisadas imediatamente. Na análise de materiais orgânicos de baixo

peso molecular, é, entretanto, aconselhável verificar se o material não foi

perdido durante o tratamento com vácuo.

A diálise é outra técnica mais familiar para o biólogo do que para o

químico. Uma membrana semipermeável (acetato de celulose ou material

semelhante com poros de diâmetro de 1 a 5 nm) é normalmente colocada

entre duas soluções contendo concentrações diferentes de íons metálicos em

água. Após um certo período de tempo, que pode chegar até a 48 horas, as

espécies pequenas (íons) passam pela membrana para igualar as

concentrações. Em aplicações biológicas, uma das fases contém espécies

iônicas e biomoléculas grandes e a outra é água pura. O equilíbrio que se

estabelece reduz efetivamente a concentração de íons na primeira fase sem

perdas ou alterações substanciais nas moléculas grandes, normalmente

proteínas. Este é o processo usado na dessalinização de soluções de

proteínas. Todavia, como muitos colóides têm, também, partículas com

cerca de 1 a 5 nm de diâmetro, a técnica pode ser útil na separação ou na

pré-concentração de certas soluções coloidais inorgânicas pouco estáveis. A

técnica pode ser também usada na preparação de amostras para análise por

métodos instrumentais. Assim, por exemplo, costuma-se eliminar as

proteínas de amostras antes de usar a cromatografia líquida de alta

eficiência porque as proteínas podem dificultar o processo de separação e

entupir irreversivelmente a coluna.

 

6.7 Separações instrumentais Mencionamos, no início deste capítulo, que as separações são classificadas

em dois grupos, de acordo com a quantidade de analito: separações em

grande escala e separações instrumentais. Apesar de a maior parte do

material descrito nesta seção ser uma introdução aos Caps. 7, 8 e 9, que

tratam das separações instrumentais, estes processos são cada vez mais

usados, com o auxílio de aparelhagens simples, em separações e pré-

concentrações antes da cromatografia ou de outra técnica instrumental de

rotina. Todos os processos descritos a seguir relacionam-se à diferença de

afinidade de analitos em relação a duas fases em contato.

Para nossos fins, podemos considerar que uma das fases permanece

estacionária enquanto a outra pode se mover (a fase móvel). Assim, a

separação ocorre na interface entre a fase móvel e a fase estacionária. Até

recentemente, a maior parte dos analistas leria a frase anterior como uma

definição razoável de um processo cromatográfico. Com o uso crescente,

porém, dos métodos eletroforéticos, que também separam analitos em

interfaces, a definição de “cromatografia” tornou-se menos clara. Por isso,

quando consideramos separações de substâncias semelhantes na interface

de uma fase fixa e outra móvel, não importa como queiramos chamar o

processo, devemos primeiramente considerar o que está realmente

acontecendo. Só depois de feito isto é que o analista usa seus

conhecimentos químicos de modo a obter da maneira mais eficiente a

separação desejada. Isto geralmente não é simples porque, como existem

várias técnicas capazes de separar uma dada mistura, não existem

procedimentos preferenciais: eles freqüentemente se equivalem.

A escolha do método de separação é normalmente feita com base na

sensibilidade, na velocidade de obtenção dos resultados ou até mesmo na

disponibilidade de equipamentos e materiais. Não é necessário procurar

obter sempre a separação máxima dos componentes. É aqui que a

experiência do analista é mais importante. Existem, entretanto, diretrizes

que, se usadas com cautela, ajudam a simplificar o processo. Assim,

moléculas orgânicas de baixo peso molecular, voláteis e neutras, são

geralmente separadas por cromatografia com fase gasosa, enquanto íons ou

moléculas facilmente transformadas em íons são, geralmente, separadas usando eletroforese, especialmente no caso de moléculas de alto peso

molecular. Por outro lado, apesar de a cromatografia e a eletroforese terem

se desenvolvido de modo diferente e produzido suas próprias terminologias

e de nem sempre aparecerem nos mesmos textos, as duas técnicas

compartilham o mesmo mecanismo simples de migração diferenciada do

analito através de uma fase estacionária. Assim, de uma maneira geral, os

problemas e limitações são os mesmos. Isto significa que,

independentemente da escolha da técnica, só é possível obter separações

confiáveis, reprodutíveis e eficientes se o analista puder controlar a química

e a física das fases móvel e estacionária. Pequenas mudanças de

composição química e de temperatura podem causar grandes mudanças no

processo de separação.

 

6.7.1 Mecanismos de separação em uma interface

 

Todos os cinco mecanismos descritos nesta seção podem ocorrer em fase

líquida. Na fase gasosa (cromatografia com fase gasosa) somente a

adsorção e a partição são possíveis. Estima-se que cerca de 20% dos

produtos químicos conhecidos são suficientemente estáveis e voláteis para

serem separados por cromatografia com fase gasosa. Em princípio, os

demais 80% poderiam ser separados por cromatografia líquida, mas, na

prática, algumas misturas podem ser mais facilmente separadas por

eletroforese.

 

Adsorção

 

A adsorção é provavelmente o mecanismo mais conhecido e menos usado

em cromatografia, apesar de a adsorção de um gás ou de um líquido na

superfície de um sólido ser um processo que tem muitas aplicações

científicas e comerciais. A adsorção de gases e vapores em carvão ativo,

por exemplo, é usada em muitas residências para a remoção de odores nos

exaustores de fogão. O carvão é utilizado em muitos processos industriais

na remoção de impurezas coloridas de soluções como, por exemplo, na

produção de açúcar. Outros adsorventes muito empregados são a sílica ou sílica gel, que é uma forma muito hidratada de dióxido de silício

(SiO2·xH2O), com área superficial muito grande, e o óxido de alumínio

(Al2O3·xH2O), mais conhecido como alumina.

O problema do uso da adsorção nas separações é que a interação tende a

ser tão forte que, uma vez adsorvidos, os analitos são dessorvidos com

dificuldade, o que torna, em certas circunstâncias, a cromatografia difícil ou

pouco confiável. Apesar disso, a adsorção é usada em cromatografia líquida

e em cromatografia com fase gasosa. No caso da cromatografia com fase

gasosa, a desativação das superfícies de sílica em injetores e em colunas é

essencial para reduzir a adsorção e permitir que a separação ocorra por

outro mecanismo.

 

Partição

 

A teoria da partição foi discutida na Seção 6.3.2 quando consideramos a

separação líquido–líquido em grande escala. A partição, contudo, também é

muito usada em separações cromatográficas e, neste caso, o que interessa é

a solubilidade relativa do soluto em duas fases imiscíveis. Na

cromatografia com fase gasosa, o processo implica a partição do soluto

entre uma fase móvel gasosa e uma fase estacionária líquida depositada

sobre pequenas partículas em colunas empacotadas ou ligadas

quimicamente às paredes internas de uma coluna capilar. A partição é o

mecanismo de separação mais comum em cromatografia com fase gasosa.

A solubilidade relativa dos analitos entre uma fase móvel líquida e uma fase

estacionária é mais importante em cromatografia líquida de alta eficiência.

A fase estacionária é normalmente ligada a um suporte inerte para evitar

problemas de dissolução na fase móvel (Cap. 8). Uma regra simples que

funciona na cromatografia de partição é: “semelhante separa semelhante”.

Materiais não polares dissolvem-se e são separados em fases não polares.

Materiais polares requerem fases estacionárias ainda mais polares.

 

Afinidade A afinidade é o mecanismo mais recentemente utilizado e o mais seletivo

dentre todos. Ela se baseia no aproveitamento de interações muito

específicas que podem existir entre a fase imóvel e certos solutos. Estas

interações são, usualmente, provocadas por reações enzimáticas ou de

anticorpo-antígeno e podem ter seletividade muito elevada para um

determinado tipo de molécula como, por exemplo, proteínas em misturas

complexas. Sabe-se que os anticorpos são extremamente específicos em

suas reações com antígenos e isso pode ser aproveitado na cromatografia

por afinidade. No processo, um anticorpo imobilizado em uma fase

estacionária (por meio de uma ligação covalente) pode reagir com uma

determinada proteína (antígeno) em uma mistura que contém várias

centenas de proteínas semelhantes, ligando-a à coluna. Após lavar a coluna

para a remoção das demais proteínas, muda-se a força iônica do eluente

para liberar a substância desejada que é então coletada [9].

O mecanismo é, às vezes, descrito como efeito “chave e fechadura”

devido à alta especificidade entre a fase estacionária e o analito. Este

mecanismo, que é usado apenas na fase líquida, simplificou grandemente a

separação e a determinação de misturas biológicas que, até recentemente,

eram consideradas difíceis demais para separar. Os princípios básicos das

separações por imunoafinidade usadas em biotecnologia foram revistos

recentemente [10]. Como as fases estacionárias contêm um material

biologicamente ativo, elas tendem a ser muito caras. Além disso, são muito

menos tolerantes sob condições adversas do que as fases estacionárias

convencionais. Assim, deve-se ter muito cuidado no seu emprego e sua

estocagem para garantir um tempo de vida útil razoável.

 

Troca iônica

 

Já discutimos a troca iônica, encarando-a como um processo de separação

em larga escala (Seção 6.5), mas ela pode ser também usada na

cromatografia líquida. A cromatografia de troca iônica só pode ocorrer na

fase líquida. Os íons da fase móvel ligam-se temporariamente aos contra-

íons imobilizados na fase estacionária, a resina de troca iônica, de onde podem ser seletivamente deslocados por eluição com um tampão de força

iônica crescente.

Já vimos, neste capítulo, o uso da troca iônica para separar dois ou mais

íons em larga escala. Misturas bastante complexas de íons ou de espécies

ionizadas, especialmente substâncias de interesse biológico tais como

amino-ácidos, também têm sido separadas por esta técnica, com o auxílio

de colunas convencionais de 10 mm de diâmetro ou mais e eluição por

gravidade. A vantagem é que quantidades relativamente elevadas de

material (> 1 mg) podem ser separadas e isoladas para uso em outros

experimentos. Além disso, as técnicas de troca iônica podem ser adaptadas

para uso em cromatografia líquida de alta eficiência. Neste tipo de

aplicação, escolhem-se partículas de resina sintética suficientemente

pequenas para tornar eficiente a coluna. Às vezes, os grupos de troca iônica

estão ligados à superfície das partículas de sílica, de maneira semelhante às

colunas de partição de fase ligada. Este processo leva a uma partícula rígida

com propriedades de troca iônica. Usam-se, normalmente, detectores de

condutividade porque as espécies usualmente separadas na cromatografia

líquida de alta eficiência acoplada à troca iônica não são determinadas com

facilidade com detectores de UV. Embora os processos envolvidos sejam

intrinsecamente os descritos na Seção 6.5, esta versão de alto desempenho

da troca iônica é mais conhecida como cromatografia iônica. A

cromatografia iônica pode ser usada para a separação de ânions ou de

cátions, independentemente do tamanho dos íons, mas atualmente sua maior

utilidade analítica está na separação e determinação dos ânions mais

comuns (F– – – – – – 2– 3– , Cl , Br , I , NO , NO , SO , PO etc.) em água,

2 3 4 4

particularmente em águas naturais e, também, de cátions e ânions em

alimentos [11].

 

Permeação em gel

 

A permeação em gel é um mecanismo simples de separação de espécies

segundo seu tamanho. Usam-se outros nomes, também, como filtração em

gel, cromatografia de exclusão molecular e peneira molecular. Esta última

denominação é hoje pouco usada, mas talvez seja a mais descritiva de todas. A fase estacionária é um material polimérico conhecido como gel.

Dentre os géis mais utilizados estão os materiais conhecidos como

Sephadex, produzidos pela indução de graus variáveis de ligações cruzadas

em uma estrutura do tipo dextrano (carboidrato polimérico) (Fig. 6.5). O

controle do número de ligações cruzadas permite a produção de poros de

diferentes tamanhos na estrutura levando a “peneiras” capazes de separar as

moléculas de acordo com seu tamanho.

Os Sephadex de porosidade diferente podem ser usados para a separação

de moléculas biológicas como peptídeos e proteínas de tamanhos muito

diferentes: a resina Sephadex G-10 é usada para moléculas de massa

molecular relativa (RMM) até 700 e a resina Sephadex G-200 para

moléculas com RMM até 750000. Os géis de Sephadex são razoavelmente

polares e absorvem água (com considerável inchamento). Já os géis

reticulados baseados em poliacrilamidas (Bio-Gel) ou em poliestireno

(Styragel) além de serem completamente inertes em relação à água também

podem ser usados em sistemas formados por solventes orgânicos comuns,

tais como o tolueno e o cloreto de metileno. Veremos na Seção 8.2.4 o

aproveitamento de géis com exclusão pelo tamanho na separação de

moléculas grandes por cromatografia líquida. A exclusão pelo tamanho

também encontra aplicação na separação de moléculas pequenas,

notadamente gases, por cromatografia com fase gasosa. Neste caso, a fase

estacionária baseia-se em matrizes inorgânicas com orifícios de diâmetro

suficiente para separar moléculas pequenas de gases e é comumente

denominada peneira molecular.

Na cromatografia de exclusão por tamanho ou permeação em gel, as

moléculas grandes são sempre eluídas primeiro, seguindo-se

sucessivamente moléculas cada vez menores. Isto acontece porque as

moléculas pequenas podem penetrar mais profundamente nos orifícios do

gel e são mais fortemente retidas do que as moléculas maiores que não

podem fazer o mesmo. (É aqui que a analogia com as peneiras falha porque

no caso das peneiras são as partículas menores que passam mais

rapidamente.) Existe um estudo detalhado feito no caso da separação de

macromoléculas em que se compara a permeação em gel (onde as moléculas grandes eluem primeiro) e a eletroforese (onde as moléculas

menores deslocam-se mais rapidamente) [12].

 

Fig. 6.5 Estrutura parcial da resina Sephadex