Vogel: Análise Química Quantitativa
8.7 Derivatização
Fig. 8.12 Separação dos enantiômeros da benzodiazepina Temazepam: coluna (4,6 mm × 150 mm) de HSA quiral; fase móvel tampão fosfato 0,05 M (pH 6,9) e acetonitrila (mistura 9:1); taxa de fluxo 1,5 ml·min–1; detector UV em 254 nm
Como todas as proteínas, HSA é sensível à temperatura, força iônica, modificadores orgânicos e, particularmente, pH, o que faz com que estas colunas quirais, muito caras, devam ser manuseadas e usadas com cuidado. Embora sejam estáveis entre pH 6 e 8, as separações são normalmente feitas com uma concentração baixa de tampão fosfato (0,05 M) em pH 7 com 1-propanol ou acetonitrila em concentração até 10–15% como modificador orgânico. Estas colunas estão sendo
muito usadas na separação quiral de materiais neutros e ácidos, particularmente drogas. A Fig.
8.12 ilustra uma separação típica, a de diazepam. Para materiais biológicos mais básicos, a glicoproteína alfa-1-ácido dá separações melhores. Alguns fabricantes fornecem colunas deste tipo especialmente desenhadas para aplicações específicas. Além das aplicações analíticas deste tipo de coluna, pode-se determinar, também, as características da ligação das drogas com HSA. A medida direta da afinidade pode ser relacionada ao comportamento farmacocinético e farmacológico de novos compostos mais rapidamente do que as informações obtidas com técnicas tradicionais como a diálise ou a centrifugação.
8.7 Derivatização
Na cromatografia com fase líquida, ao contrário do que ocorre na cromatografia com fase gasosa (Seção 9.2), é sempre necessário preparar derivados para melhorar a resposta de um dado detector à substância de interesse analítico. No caso de compostos que não têm um cromóforo que absorve na região de 254 nm, por exemplo, mas têm um grupo funcional reativo, a derivatização permite a introdução de um cromóforo que pode ser detectado. A preparação dos derivados pode ser feita antes da separação (derivatização antes da coluna) ou depois (derivatização depois da coluna). As técnicas mais usadas são a derivatização antes da coluna e fora de linha e a derivatização em linha depois da coluna.