Vogel: Análise Química Quantitativa
8.8 Análise quantitativa
A derivatização antes da coluna e fora de linha não exige modificações da aparelhagem e impõe, em comparação com as técnicas de derivatização depois da coluna, menos limitações às condições de reação. As desvantagens são a presença de reagente em excesso, a possibilidade de interferência na separação provocada por subprodutos e alterações nas propriedades cromatográficas das moléculas de interesse devidas ao grupo químico introduzido.
A derivatização em linha depois da coluna é feita em um reator especial situado entre a coluna e o detector. Uma característica desta técnica é que a derivatização não precisa ser completa, desde que a reação seja reprodutível. A reação, entretanto, deve ser rápida em temperaturas moderadas e o detector não deve responder ao excesso de reagente. Uma vantagem da derivatização depois da coluna é que, idealmente, as etapas de separação e detecção podem ser otimizadas separadamente. Um problema que ocorre é que o melhor eluente para a separação cromatográfica raramente é o melhor solvente para a derivatização. Este problema é particularmente importante no caso de detectores eletroquímicos que só operam corretamente em uma faixa limitada de pH, de força iônica e de composição em água do solvente.
Reagentes de derivatização que absorvem fortemente no UV/visível são, às vezes, chamados de marcadores de cor (chromatags). Um exemplo é o reagente ninidrina, comumente usado para derivatizar amino-ácidos, que absorve em 570 nm, aproximadamente. A detecção por fluorescência baseia-se na reação entre substâncias não-fluorescentes e solutos para formar substâncias fluorescentes. Estes reagentes não-fluorescentes são, às vezes, chamados de marcadores de fluorescência (fluorotags). O reagente cloreto de dansila [8.A] é usado para preparar derivados fluorescentes de proteínas, aminas e fenóis. Seu comprimento de onda de excitação é 335–365 nm e de emissão, 520 nm.
Consulte um livro-texto apropriado [18] para detalhes da derivatização química em cromatografia com fase líquida. Veja também a Seção 8.10.
8.8 Análise quantitativa
Idealmente, a análise quantitativa em HPLC requer uma relação linear entre a magnitude do sinal e a concentração de um determinado soluto da amostra. A intensidade do sinal é dada pela área do pico ou pela altura do máximo. Quando o fluxo da coluna puder ser controlado com precisão, é melhor usar a área do pico, que é relativamente independente da composição da fase móvel. Em geral, os sistemas de HPLC já têm incorporados sistemas computadorizados de tratamento de dados e quando concentrações padronizadas são usadas para preparar as curvas de calibração, é possível obter automaticamente um conjunto de resultados para cada composto isolado, relacionado com os tempos de retenção. Lembre-se, entretanto, de que a resposta do detector é diferente para cada componente de uma mistura, mesmo que eles sejam semelhantes quimicamente, e que pode ser necessário corrigir os dados para levar em conta os fatores de resposta relativos (Seção 8.4).