Vogel: Análise Química Quantitativa
17.4 Métodos de medida da “cor”
É importante distinguir entre os espectros de emissão e excitação de fluorescência.
Os espectros de emissão são produzidos com a excitação em comprimento de onda fixo e o espectro é registrado como a intensidade da emissão em função do comprimento de onda da emissão. Os espectros de excitação são obtidos por variação do comprimento de onda de excitação e medida da intensidade de fluorescência em um comprimento de onda fixo. Excitação não é a mesma coisa que absorção. Os fatores que provocam desvios da lei de Beer na absorção têm efeito semelhante na fluorescência. Qualquer material que faz com que a intensidade da fluorescência fique menor do que o valor esperado pela Eq. 17.15 é um inibidor (quencher) e o efeito que ele provoca é chamado de inibição (quenching). Este efeito é normalmente provocado por íons ou moléculas estranhos à análise. A fluorescência é afetada pelo pH da solução, pela natureza do solvente, pela concentração dos reagentes adicionados na determinação de íons inorgânicos e, às vezes, pela temperatura. O tempo necessário para que a fluorescência chegue ao máximo depende muito da reação que produz a espécie fluorescente.
Um aspecto importante da inibição, em química analítica, é que a fluorescência de
um analito pode ser inibida por algum composto presente na amostra — um exemplo de efeito de matriz. Se a concentração da espécie inibidora é constante, a inibição pode ser compensada pelo uso de padrões adequados, isto é, que contêm a mesma concentração do inibidor, porém podem ocorrer dificuldades quando a concentração do inibidor varia de forma imprevisível.
17.4 Métodos de medida da “cor”
O princípio básico da maior parte das técnicas colorimétricas é a comparação, em condições bem-definidas, da cor produzida por uma substância que está em concentração desconhecida em uma amostra com a mesma cor produzida por uma quantidade conhecida do mesmo material. Quando se usa um espectrofotômetro, não é essencial preparar uma série de padrões. O coeficiente de absorção molar pode ser calculado com a medida da absorbância ou da transmitância de uma solução padrão e a concentração desconhecida obtida com a ajuda do coeficiente de absorção molar e do valor observado da absorbância ou da transmitância (veja as Eqs. (17.12) e (17.13)). Dois métodos importantes, a absorciometria e a espectrofotometria, são descritos brevemente aqui e com mais detalhes nas Seções 17.5 e 17.6. Para um tratamento mais completo da comparação visual veja as edições mais antigas deste livro.
Método do fotômetro fotoelétrico Neste método, o olho humano, que era usado antigamente nas técnicas visuais, é substituído por uma célula fotoelétrica adequada. A célula fotoelétrica mede diretamente a intensidade da luz e, portanto, da absorção. Os instrumentos que incorporam células fotoelétricas medem a absorção da luz e não a cor da substância e, por isso, o uso do termo “colorímetro fotoelétrico” é impróprio. Nomes melhores são comparador fotoelétrico, fotômetro fotoelétrico ou, melhor ainda, absorciômetro. Estes instrumentos são compostos essencialmente por uma fonte de luz, um filtro apropriado, para assegurar que a luz seja aproximadamente monocromática (daí o nome fotômetro fotoelétrico de filtro), uma célula de vidro, para a solução, uma célula fotoelétrica, que recebe a radiação transmitida pela solução, e um medidor, para determinar a resposta da célula fotoelétrica. O comparador é inicialmente calibrado com uma série de soluções de concentração conhecida e o resultado lançado em um gráfico de concentração contra a leitura do medidor. A concentração da solução desconhecida é determinada pela resposta da célula fotoelétrica na curva de calibração.
Os absorciômetros são oferecidos em diversos modelos, com uma ou duas
fotocélulas. Quando o instrumento só dispõe de uma fotocélula, mede-se diretamente a absorção da luz pela solução determinando a corrente elétrica da fotocélula em relação à corrente obtida com o solvente puro. É absolutamente essencial usar uma fonte de luz de intensidade constante. Se a fotocélula apresentar o chamado “efeito de fadiga”, é necessário esperar que ela chegue ao equilíbrio após cada mudança da intensidade da luz. Os instrumentos que têm duas fotocélulas são mais confiáveis (desde que o circuito elétrico tenha sido adequadamente planejado) porque se elas tiverem a mesma resposta espectral, os efeitos de flutuação da intensidade da luz afetam ambas as células do mesmo modo. As duas fotocélulas, iluminadas pela mesma fonte de luz, são balanceadas uma contra a outra por um galvanômetro. A solução-teste é colocada antes de uma das células e o solvente puro antes da outra. O galvanômetro indica a diferença de corrente nas duas fotocélulas.
Método espectrofotométrico
Este é, sem dúvida, o método mais acurado de determinação, entre outras coisas, da concentração de substâncias em solução, mas os instrumentos são obviamente mais caros. Um espectrofotômetro pode ser visto como um fotômetro fotoelétrico de filtro mais complexo, que permite o uso de faixas de luz quase monocromáticas que podem variar continuamente. As partes essenciais de um espectrofotômetro são (1) uma fonte de energia radiante, (2) um monocromador, isto é, um dispositivo capaz de isolar um feixe de luz monocromática ou, mais exatamente, bandas estreitas da energia radiante proveniente da fonte de luz, (3) células de vidro ou de quartzo, para o solvente e a solução-teste, e (4) um dispositivo para receber ou medir o feixe ou feixes de energia radiante que passam pelo solvente ou pela solução.