Vogel: Análise Química Quantitativa
17.38 Colesterol em maionese
Discussão O colesterol é oxidado por colesterol-oxidase:
Na presença de catalase, o peróxido de hidrogênio produzido na reação oxida metanol a formaldeído (metanal):
O formaldeído reage com acetilacetona (pentano-2,4-diona) para formar o corante amarelo de lutidina na presença de íons amônio:
A concentração do corante de lutidina formado corresponde estequiometricamente à concentração de colesterol e é medida pelo aumento da absorbância no visível em 405 nm.
Reagentes Conjunto de teste O conjunto, fornecido por Boehringer Mannheim, é suficiente para cerca de 25 determinações. São três garrafas:
Garrafa 1 com aproximadamente 95 ml de uma solução contendo o tampão fosfato de
amônio (pH 7,0), 2,06 mol·l–1 de metanol, catalase e estabilizadores.
Garrafa 2 –1 com aproximadamente 60 ml de uma solução contendo 0,05 mol·l de
acetilacetona, 0,3 mol·l–1 de metanol e estabilizadores.
Garrafa 3 com aproximadamente 0,8 ml de uma suspensão de colesterol-oxidase.
Reagente de colesterol Misture três partes da solução da garrafa 1 com duas partes da solução da garrafa 2 em uma garrafa escura mantida na temperatura do laboratório. Deixe a mistura em repouso nesta temperatura por 1 hora antes do uso.
Solução 3 Use o conteúdo da garrafa 3 sem diluição.
Outros reagentes Solução de hidróxido de potássio 1,0 M em metanol, recentemente preparada.
Procedimento Pese com acurácia cerca de 1 g de maionese e 1 g de areia do mar em um frasco de 50 ml e fundo redondo. Adicione 10 ml da solução de hidróxido de potássio em metanol e aqueça sob refluxo por 25 minutos, com agitação constante. Transfira com uma pipeta a solução supernadante para um balão aferido de 25 ml. Aqueça o resíduo duas vezes com porções de 6 ml de 2-propanol de cada vez por 5 minutos. Colete as soluções no balão aferido e deixe esfriar. Complete o volume do balão com 2-propanol e misture. Se as soluções estiverem turvas, filtre em papel de filtro estrelado. Use a solução límpida para o teste. A solução-teste deve conter entre 0,07 e 0,4 g·l −1 de colesterol.
Para preparar o branco, transfira com uma pipeta 5,000 ml do reagente de colesterol
e 0,400 ml da solução límpida da amostra para um tubo de ensaio de vidro. Misture bem. Em um outro tubo de ensaio de vidro coloque 2,500 ml do branco e adicione 0,020 ml da solução 3. Esta é a amostra. Misture bem. Cubra ambos os tubos e incube por 60 minutos em um banho de água a 37–40°C. Deixe esfriar até a temperatura do laboratório. Leia as absorbâncias em 405 nm do branco e da amostra, uma depois da outra, na mesma cubeta, contra o ar como referência. Subtraia a absorbância do branco da absorbância da amostra (= ΔA). Para que a acurácia seja suficiente, ΔA deve ser pelo menos igual a 0,100.
Cálculos –1 A concentração c (g·l) é dada por
onde
V = volume final (5,400 mL)
v = volume da amostra (0,400 mL)
MW = massa molecular relativa do colesterol (386,64)
d = passo óptico (1 cm)
ε = coeficiente de absorção (7,4 l·mmol –1 –1 cm)
f = fator de diluição = 2,52/2,5 = 1,008
isto é, c = 0,711ΔA
Assim, o conteúdo de colesterol na maionese (em mg/100 g) é dado por
onde w é o peso em gramas da amostra de maionese.