19.4 A fonte de íons

mas como é sempre possível introduzir pequenas quantidades de amostra de

cada vez, pode-se quantificar os componentes separados.

 

19.4 A fonte de íons

 

Mais de uma dúzia de diferentes métodos de ionização são usados

atualmente em espectrômetros de massas comerciais (Tabela 19.3). Antes

de descrever em detalhes alguns deles, examinemos a função da fonte de

íons. A fonte de íons de todos os espectrômetros de massas é usada apenas

para gerar íons em fase gasosa derivados do material de partida. O

problema desta definição simples é que o material pode ser um gás, um

líquido ou um sólido, pode ser muito polar ou ter alto peso molecular, o que

dificulta sua passagem para a fase gasosa, ou pode, ainda, ser tão lábil que

se decompõe em fragmentos menores sem se ionizar extensivamente. Cada

um destes problemas é solucionado, pelo menos em parte, pela escolha

apropriada da fonte de íons. Esta escolha, entretanto, está sujeita às

limitações do instrumento que está sendo usado.

 

19.4.1 Fontes de ionização por impacto de elétrons

 

As fontes de ionização por impacto de elétrons (EI) ainda são,

provavelmente, as mais usadas, mesmo tendo sido as primeiras fontes de

uso generalizado. Elas foram desenvolvidas entre 1920 e 1930. A fonte é

essencialmente um tubo de íons, semelhante aos utilizados nos aparelhos

comuns de televisão. Um filamento aquecido de tungstênio ou rênio emite

elétrons que são acelerados em uma câmara por uma voltagem imposta

entre o filamento e um anodo (Fig. 19.4). A amostra, que deve estar na fase

gasosa, entra nesta câmara em direção perpendicular à do feixe de elétrons e

nestas condições podem ocorrer interações como

Fig. 19.3 Um espectrômetro de massas de quadrupolo

 

M + e → M .+ .− + 2e M + e → M M + e → M*

 

Estes processos estão nesta ordem porque esta é a probabilidade de

interação observada. A perda de um elétron para formar um íon positivo é

cerca de 100 vezes mais provável do que a captura de um elétron para

formar um íon negativo. A excitação da partícula é ainda menos provável.

Mesmo no caso do primeiro processo, somente uma pequena proporção da

amostra se ioniza no feixe de íons quando o potencial do elétron, logo a

energia, é otimizado. Isto dá cerca de 1% de ionização para um feixe de energia de 70 eV (produzido pela aplicação de 70 V entre o filamento e o

anodo). Abaixo deste valor, a eficiência de ionização cai rapidamente,

embora existam boas razões para operar, eventualmente, o sistema em

potenciais da ordem de 10 eV (veja adiante). A corrente típica de um feixe

de íons em 70 eV é da ordem de 10 –10 –15 a 10A.

 

Tabela 19.3 Fontes de íons usadas em espectrometria de massas

 

Nome a Abreviação Fase Fragmentação

 

Impacto de elétrons + EI gás M e fragmentos

 

Ionização química + CI gás (M + 1) e alguns

fragmentos

 

Ionização por campo + + FI gás M ou (M + 1)

 

Dessorção por campo + + FD sólido/líquido M ou (M + 1)

 

Dessorção por ionização + DCI sólido/líquido (M + 1)

química

 

Bombardeio por átomos + + FAB líquido (M - 1) , (M + 1),

rápidos + (M + A)

 

Dessorção por plasma + 2+ PD líquido (M + 1) , (M + 2),

(M + 3)3+

 

Dessorção por laser + 2+ MALDI líquido (M + 1) , (M + 2),

(M + 3)3+

Espectrometria de massas de SIMS sólido íon do elemento ou

íons secundários + M

 

Microamostragem de íons IMP sólido íon do elemento

 

Fonte de centelhamento SS sólido íon do elemento

 

Plasma acoplado ICP líquido íon do elemento e

indutivamente íons com várias

cargas

 

Ionização na pressão + + API gás/líquido (M + 1) e (M + A)

atmosférica

 

Nebulização térmica + + TSP líquido (M + 1) , (M + A)

 

Nebulização com plasma + PS líquido (M + 1) e

fragmentos

 

Nebulização com elétrons + ES líquido (M + 1)para (M +

NH) + n onde n= 1–60

 

Interface de feixe de PBI líquido espectros EI ou CI

partículas

 

a + + (M + 1) é um íon monoprotonado, com uma carga, por exemplo, MH; A = aduto.

Fig. 19.4 Espectrômetro de setor magnético com focalização dupla

 

 

Imaginemos, por enquanto, que só se formam íons positivos estáveis.

Eles podem ser retirados da cavidade ou câmara de íons por um potencial

aplicado entre o repelente e uma fenda, de modo a produzir um feixe de

íons positivos que passa para o analisador de massas. Como descrito, o

processo parece, e é, simples, porém a construção da fonte de íons é mais

complexa do que pode parecer. Ela contém freqüentemente mais de uma

centena de pequenas peças que fornecem campos magnéticos ou

eletrostáticos nas várias regiões da fonte. Esta complexidade é necessária

para focalizar o feixe de íons no analisador. No caso dos instrumentos de

setor magnético é também necessário fornecer energia cinética suficiente

para que os íons passem pelo analisador. Potenciais acima de 10 kV devem

ser usados para dar aos íons a velocidade adequada.

A complexidade também implica que, quando a fonte se contamina com

a passagem das amostras, a limpeza é um processo delicado e demorado.

Este problema é menor nos instrumentos mais modernos nos quais os fabricantes colocam a fonte de íons em um compartimento que pode ser

removido facilmente e a fonte, substituída por uma outra, limpa. Em um dos

instrumentos comerciais, a fonte chega a ser classificada como descartável!

Outras razões para manter o alto vácuo no compartimento da fonte são

óbvias: na pressão atmosférica o filamento seria consumido rapidamente e,

além disso, existe a possibilidade de ocorrência de centelhas entre

componentes muito próximos submetidos a potenciais elevados.

Infelizmente, não são os problemas mecânicos ou elétricos que causam

mais problemas nas fontes, são as reações químicas que podem ocorrer. Em

uma fonte de íons por impacto de elétrons operada em 70 eV,

aproximadamente 1% da amostra — geralmente uma espécie molecular —

se ioniza no feixe. Entretanto, antes que os íons passem pelo analisador e

cheguem ao detector, um certo número de reações ocorrem. O produto

primário da ionização, o íon molecular, tem energia em excesso que deve

ser dissipada através de alguns processos de fragmentação:

 

Observe que uma carga e um elétron desemparelhado são mantidos em um

ou ambos os fragmentos. São estes processos de fragmentação que dão ao

analista as informações sobre as espécies moleculares que permitem o

diagnóstico da estrutura da amostra. Além do espectro de massas complexo

que resulta do processo, entretanto, a fragmentação causa problemas.

Muitas moléculas se fragmentam tão facilmente que não se consegue

observar o íon molecular, tão importante para o diagnóstico da estrutura.

Outro problema é que a distribuição dos íons fragmentados depende da

energia de ionização do feixe de elétrons, da temperatura da fonte de íons,

da pressão e mesmo da geometria do percurso dos íons no espectrômetro. O primeiro destes problemas pode ser reduzido operando-se o sistema entre

70 e 10 eV, faixa em que o processo de fragmentação se reduz (a energia

das ligações químicas das moléculas orgânicas está na faixa 14–20 eV)

dando um espectro de massas simplificado. O problema é que a

sensibilidade da determinação cai drasticamente em voltagens baixas.

O segundo problema pode ser uma vantagem porque pode-se obter

informações cinéticas importantes medindose os espectros de massas em

diferentes condições experimentais. Para as aplicações analíticas de rotina,

entretanto, a fragmentação obtida sob 100 μPa (pressão suficientemente

baixa para tornar as colisões entre moléculas pouco prováveis) e em 70 eV

produz espectros muito semelhantes em instrumentos diferentes, permitindo

a comparação entre o espectro de uma amostra e um espectro de referência

obtido de bibliotecas computadorizadas. O processo pressupõe, porém, que

a molécula não se decompõe antes da ionização ao se volatilizar no sistema

de admissão da amostra.

Os espectros EI são geralmente obtidos com íons positivos mas é

possível, invertendo as voltagens na fonte de íons, obter espectros de íons

negativos. Para a maior parte dos compostos, entretanto, os espectros de

íons negativos são muito menos intensos, o que reduz uma das vantagens

principais das fontes de impacto de elétrons — sua grande sensibilidade em

comparação com outras técnicas de ionização. Ainda assim, no caso de

espécies eletrofílicas como os compostos halogenados, os espectros de íons

negativos são muito úteis.

 

19.4.2 Fontes de ionização química

 

É freqüentemente desejável reduzir a fragmentação na fonte de íons, de

modo a simplificar a interpretação do espectro de moléculas de peso

molecular elevado. Isto pode ser conseguido, em muitos casos, com a

ionização química (CI), na qual provoca-se a colisão das moléculas no

compartimento de ionização. A maneira mais comum de construir uma

fonte CI é modificar uma câmara de EI para que ela mantenha a pressão

entre 0,1 e 1,0 torr (10 a 100 Pa) na fonte e o resto do sistema em pressão reduzida. Com freqüência, o instrumento permite usar uma válvula para

converter facilmente a fonte de EI para CI. Estas fontes alternam CI e EI

(ACE). No modo CI, admite-se no compartimento de ionização um fluxo

constante de um reagente na fase gasosa. Com metano ocorrem as seguintes

reações:

 

Este é o processo de ionização normal, descrito anteriormente, porém usa-

se elétrons com energia da ordem de 200 a 500 eV. À ionização primária

segue-se um segundo processo em que os íons colidem com outra molécula

do gás reagente,

 

para produzir um “plasma de íons” estável na fonte que, por sua vez, reage

com as moléculas da amostra (MH) por transferência de próton ou,

ocasionalmente, de hidreto. São reações de transferência de próton:

 

Os hidrocarbonetos alifáticos reagem, também, por transferência de hidreto:

 

Observe que estes processos produzem íons (M + 1)+ + ou (M – 1) e o que se

observa no espectro são estes íons pseudomoleculares e não o íon

molecular, M + + + . Também pode ocorrer adição de C H e C Hpara dar íons

2 5 3 8

(M + 29) + + e (M + 41). A ionização química é um processo menos agressivo

do que a ionização por impacto de elétrons e dá um espectro mais simples e

fácil de interpretar, como se pode ver, para a acetofenona, na Fig. 19.5.

Embora o metano tenha sido usado como reagente nos exemplos dados

anteriormente, pode-se preferir usar em algumas amostras outros gases como amônia ou isobutano, igualmente eficientes. A eficiência da

transferência de energia da base conjugada do reagente para a amostra

depende da afinidade relativa pelo próton (acidez) da amostra em relação à

base conjugada. Amônia é mais eficiente para moléculas básicas como

aminas ou amidas mas não dá espectros CI para hidrocarbonetos e outras

moléculas nãopolares. Ela tende a produzir íons de adição (M + NH + )muito

4

intensos. Nas altas pressões usadas nos compartimentos de CI, a captura de

elétrons é tão provável como a abstração de elétrons e íons negativos são

produzidos com grande rendimento. Isto torna a ionização química com

íons negativos (NCI) uma técnica interessante para moléculas muito

eletronegativas como as de muitos pesticidas.

Reagentes típicos são hexafluoro-benzeno, diclorometano, óxido nitroso

e óxido nitroso/metano, que dão os íons negativos F – – – – , Cl , O e OH,

respectivamente. Estes reagentes são admitidos na fonte de íons em

pressões iguais ou superiores a 1 torr (100 Pa) onde ocorrem reações de

abstração de prótons como

 

Alguns espectrômetros comerciais podem fazer espectros de ionização

química positivos ou negativos muito rapidamente e ambas as técnicas

podem ser aplicadas às mesmas amostras durante a eluição de uma coluna

cromatográfica. Nos casos favoráveis, os espectros CI positivos podem ter

sensibilidade comparável à dos espectros EI. A sensibilidade dos espectros

CI negativos pode ser uma ordem de grandeza superior à dos espectros EI.

Ambos os métodos de ionização descritos até agora exigem que a amostra

esteja na fase gasosa antes da ionização. Esta limitação é importante no

caso das moléculas grandes, polares e de fácil decomposição encontradas

nas ciências farmacêuticas e biológicas. Os métodos seguintes têm em

comum o fato de serem capazes de produzir íons de amostras em fase

condensada (líquidos ou sólidos). Vamos começar pelo bombardeio com

átomos rápidos.

19.4.3 Bombardeio com átomos rápidos

 

O bombardeio com átomos rápidos (FAB) desenvolveu-se

independentemente da espectrometria de massas, porém tornou-se uma

técnica muito confiável para espécies de peso molecular elevado. O feixe de

átomos rápidos, usualmente xenônio ou argônio, é produzido em uma

pistola de átomos e focalizado em um alvo sólido. O feixe de íons argônio é

produzido inicialmente por uma fonte incandescente de íons em atmosfera

de gás argônio. Os íons são acelerados em um campo elétrico e entram em

uma segunda câmara que contém átomos neutros na pressão de 10 –5torr (1

mPa) onde ocorrem colisões entre íons e átomos excitados termicamente.

Alguns átomos adquirem energia adicional da ordem de 20 a 30 keV,

tornando-se átomos rápidos. Os íons são removidos por uma placa

carregada, deixando um feixe de átomos de alta energia que pode ser

focalizado em um alvo. A amostra, dissolvida em uma matriz formada por

um líquido pouco volátil como glicerol ou carbowax, é colocada no alvo.

Fig. 19.5 Acetona: (a) espectro El, (b) espectro Cl usando metano

 

O feixe de átomos produz calor intenso no ponto de contato e energia se

transfere do feixe para moléculas da amostra, produzindo íons em fase gás.

A matriz líquida tem papel importante neste processo, reduzindo,

provavelmente, a energia da rede cristalina da amostra e permitindo a

transferência de energia do feixe para a amostra, bem como fazendo com

que as moléculas da superfície se renovem e novas moléculas fiquem

expostas à radiação. Neste processo de dessorção, íons positivos e negativos

são ejetados da superfície e podem ser focalizados no analisador do

espectrômetro. Espectros de massas de moléculas de peso molecular acima

de 10 000 u podem ser obtidos por este processo [3]. Os espectros são, em

geral, simples e mostram alta intensidade de íons moleculares ou

pseudomoleculares como resultado de transferência de próton, (M + 1) +,

transferência de hidreto, (M – 1) + + , ou formação de adutos, (M + G), onde G

é glicerol, e também alguns picos de fragmentação (Fig. 19.6). Alguns

espectros mostram, ainda, espécies catiônicas que incluem um átomo de

metal, freqüentemente sódio, com massas (M + 23)+.

Uma desvantagem da técnica é que os espectros da matriz também são

observados, ainda que em massas muito inferiores às da amostra. Pistolas

de átomos rápidos já são normalmente encontradas nos espectrômetros mais

modernos e algumas delas podem ser adaptadas para uso em espectrômetros

mais antigos, permitindo a determinação de espectros de substâncias de

massa elevada. Versões dinâmicas desta fonte de íons também podem ser

encontradas para uso como fontes contínuas ou em linha acopladas a HPLC

(Seção 19.11.2).

 

19.4.4 Pistolas de íons

 

Como a técnica do bombardeio com átomos rápidos, as pistolas de íons,

também desenvolvidas nos laboratórios de física, bombardeiam a amostra

com um feixe de partículas, no caso íons. Quando usadas em sólidos

inorgânicos, a técnica é geralmente conhecida como espectrometria de

massas de íons secundários (SIMS) e tem sido muito usada no estudo de superfícies. De alguns anos para cá, a técnica da pistola de íons tem sido

aplicada no estudo de espécies orgânicas de massa elevada dissolvidas em

matrizes líquidas, geralmente glicerol. Muitas denominações foram dadas

para esta técnica, dentre elas o acrônimo LSIMS (espectrometria de massas

de íons secundários em líquidos), que parece o mais lógico. Alguns

fabricantes não distinguem o feixe de íons do feixe de átomos e chamam

ambas as técnicas de FAB. Embora outros íons, incluindo gases inertes

como o argônio, possam ser usados, íons de césio, muito eletropositivos,

com energias da ordem de 30 a 40 keV, parecem ser os mais adequados para

a espectrometria de massas de compostos orgânicos. Os espectros SIMS são

muito semelhantes aos espectros FAB, porém têm sensibilidade mais alta.

 

Fig. 19.6 Uma fonte FAB e o espectro FAB de NAD. (C 21H27N7O14P2)

 

19.4.5 Espectrometria de massas com dessorção por laser

 

Resultados semelhantes podem ser obtidos com a focalização de uma série

de pulsos de um laser de alta potência em uma amostra previamente misturada com uma matriz adequada e seca. Como o pulso de laser dura

apenas alguns milissegundos, usa-se normalmente um sistema para a

medida de tempo de vôo (TOF). Os resultados obtidos são armazenados e

sua média é o espectro desejado. O tempo de operação é pequeno

(tipicamente 5 minutos entre a colocação da amostra e a impressão do

espectro). O sistema é sensível (até 1 pmol) e pode ser totalmente

automatizado, com amostragem e eliminação da amostra robotizadas. Como

o analisador é um TOF, em princípio não há limites para a massa molecular

da amostra e há casos de determinações de massas superiores a 200 000 u

[4]. As massas moleculares habitualmente medidas, entretanto, são da

ordem de algumas poucas dezenas de milhares de unidades. Os sistemas de

dessorção por laser foram descritos inicialmente em 1988 e provavelmente

serão muito úteis na determinação de proteínas, peptídeos e outras espécies

de peso molecular elevado.

A preparação da amostra não é crítica. Prepara-se habitualmente uma

matriz orgânica simples misturando 0,1 a 1 μl da amostra com 0,5 μl da

solução e deixando secar. No caso da análise de peptídeos, costuma-se usar

os ácidos 2,5-di-hidróxi-benzóico (DHB) α-ciano-4-hidróxicinâmico porque

eles favorecem a ionização das moléculas de amostras de peso molecular

elevado, mas não produzem íons acima de 400, aproximadamente, nem

formam adutos com o íon biomolecular. Faz-se, então, evaporar a água e a

mistura é irradiada sob vácuo com a luz de um laser pulsado. Esta técnica

dá, usualmente, espectros intensos para a maior parte dos biopolímeros com

alguns picomoles de amostra. O espectro de massas é normalmente simples

e o íon molecular com carga unitária ou um aduto com metal alcalino são os

íons predominantes. Observase algumas linhas com origem na matriz, mas

estas linhas podem ser eliminadas devido a sua pequena massa. A matriz na

qual a amostra se mistura, entretanto, tem um papel crítico na etapa de

ionização, permitindo a transferência de energia do laser para a amostra, e,

por isso, os acrônimos MALDI ou MALDI-TOF (ionização por dessorção

com laser favorecidas pela matriz) são muito usados para descrever a

técnica.

Devido à simplicidade relativa e à facilidade em obter o espectro de uma

proteína em solução, por exemplo, a técnica MALDI-TOF já rivaliza com

os métodos mais convencionais como a eletroforese para a determinação do

peso molecular destas espécies. Já existem vários sistemas comerciais que

usam MALDI-TOF e pelo menos um deles, semi-automático, remove os

íons produzidos pela matriz com a ajuda de um filtro eletrostático pulsado

sincronizado com o laser e colocado antes do TOF. Aparentemente, pode-se

obter, mesmo com alguns picomoles de amostra, acurácia de 0,01% na

massa usando calibração interna. Também é possível usar MALDI-TOF e

HPLC em série na determinação direta de misturas. Uma aplicação

interessante deste tipo de sistemas a amostras não biológicas foi a primeira

observação do C 60, ou buckminsterfulereno, descoberto durante a irradiação de grafita em atmosfera de hélio com um laser pulsado de Nd:YAG [5].

 

19.4.6 Ionização sob pressão atmosférica (API)

 

As fontes descritas até agora trabalham todas em uma câmara do

espectrômetro de massas sob pressão reduzida (alto vácuo). Assim que se

formam, os íons são dirigidos para o analisador, também sob pressão

reduzida. Sabe-se há muito tempo, porém, que a eficiência de ionização é

multiplicada por um fator de até 10 4, se a ionização puder ser induzida sob

pressão atmosférica. Para isso, dois problemas sérios devem ser resolvidos:

como produzir os íons e como fazer com que eles entrem no analisador, que

opera em pressões entre 10 –4 –8 e 10torr (10 mPa a 1 μPa). As vantagens

potenciais do aumento da sensibilidade e da possibilidade de ligação direta

com uma coluna de HPLC, entretanto, catalisaram o desenvolvimento de

vários sistemas.

Como a maior parte das aplicações envolve técnicas associadas, como

ICP-MS e HPLC-MS, os detalhes serão dados nas seções relevantes, mas,

em muitos casos, a solução de amostra é convertida em um aerossol por

nebulização pneumática em um capilar e as moléculas são simultaneamente

ionizadas com calor ou um potencial elevado. A nuvem de íons resultante

passa para a zona de pressão reduzida do espectrômetro de massas através de uma abertura muito pequena ou uma série de aberturas (cones de