Vogel: Análise Química Quantitativa
17.37 Glicerol em suco de frutas
Discussão O glicerol é fosforilado por adenosina-5’trifosfato (ATP) a L-glicerol-3-fosfato. A reação é catalisada por gliceroquinase (GK):
A adenosina-5′-difosfato (ADP) formada nesta reação é reconvertido a ATP por fosfoenolpiruvato (PEP) com a ajuda da piruvato-quinase (PK) e formação de piruvato:
Na presença da enzima lactato-desidrogenase (L-LDH), o piruvato se reduz a L-lactato pela nicotinamida-adenina-dinucleotídeo reduzida (NADH) com oxidação de NADH a NAD.
A quantidade de NADH que se oxida nesta reação corresponde estequiometricamente à quantidade de glicerol. A NADH é determinada por absorção de luz em 340 nm.
Reagentes O conjunto de testes fornecido por Boehringer Mannheim contém reagentes suficientes para 30 determinações. Eles são fornecidos em cinco garrafas, três do tipo 1, uma do tipo 2 e uma do tipo 3.
Garrafa 1 contém aproximadamente 2 g de uma mistura coenzima/tampão,
consistindo do tampão glicil-glicina (pH 7,4), NADH ~ 7 mg, ATP ~ 22 mg, PEP-CHA ~ 11 mg, sulfato de magnésio, estabilizadores.
Garrafa 2 contém aproximadamente 0,4 ml de uma suspensão de piruvato-quinase e
lactato-desidrogenase.
Garrafa 3 contém aproximadamente 0,4 ml de uma suspensão de gliceroquinase.
Soluções para dez determinações Dissolva o conteúdo de uma das garrafas contendo coenzima e tampão em 11 ml de água redestilada. Deixe a solução em repouso por cerca de 10 minutos antes do uso. Os conteúdos das garrafas 2 e 3 são usados sem diluição.
Procedimento Dilua a amostra do suco de frutas até uma concentração de glicerol menor do que 0,4 g·l–1. Se o suco é turvo, filtre e use a solução transparente para o teste. Quando estiver analisando sucos fortemente coloridos, descolorize a amostra. Para isto tome 10 ml do suco e adicione cerca de 0,1 g de poliamida em pó ou polivinilpolipirrolidina. Agite por 1 minuto e filtre. Use a solução límpida, que pode estar ainda ligeiramente colorida, para a determinação. Transfira com uma pipeta 1,000 ml da solução diluída da garrafa 1, 2,000 ml de água destilada, 0,1000 ml da solução-teste e 0,010 ml da suspensão da garrafa 2 para uma cubeta. Prepare o branco em outra cubeta usando os mesmos reagentes da amostra, mas sem adicionar a soluçãoteste. Misture bem cada solução e quando a reação estiver completa (5 a 7 minutos) registre a absorbância em 340 nm contra ar ou água destilada como referência.
Inicie a reação adicionando 0,010 ml da suspensão da garrafa 3 a ambas as cubetas.
Misture bem e espere que a reação se complete (cerca de 5 a 10 minutos). Meça imediatamente a absorbância da amostra e do branco, uma após a outra, em 340 nm. Se a reação não tiver parado após 15 minutos, continue a registrar as absorbâncias até que a absorbância diminua constantemente por dois minutos. Extrapole as absorbâncias ao tempo em que a suspensão da garrafa 3 foi adicionada.
Cálculos Faça a absorbância antes da adição da garrafa 3 igual a A1 e absorbância após a adição da garrafa 3 igual a A2. Determine a diferença das absorbâncias (A1 – A2) para o branco e para a amostra:
ΔA = (A1 – A2)amostra – (A1 – A2)branco
As diferenças de absorbância medidas devem ser pelo menos 0,1 para que os resultados sejam acurados. Se ΔAamostra é maior do que 1,000, a concentração de glicerol na solução-teste é muito grande e ela deve ser diluída.
A concentração c (g·l−1) é dada por
onde
V = volume final (3,020 ml)
v = volume da amostra (0,100 ml)
MW = massa molecular relativa do glicerol (92.1)
d = passo óptico (1 cm)
ε = coeficiente de absorção (6,3 l·mmol −1 −1 cm) isto e, c = 0,4414ΔA