Vogel: Análise Química Quantitativa
17.18 Algumas aplicações da fluorimetria
F- 4,5 540 ou 330 Cloranilato de tório
No- 7,0 550 Dicloridrato de
2
sulfanilamina-N(1-
naftil)etilenodiamina
Silicato 4,5–5,0 815 Molibdato de amônio
Muitos dos métodos de análise no ultravioleta são baseados na medida do aumento
ou da diminuição da absorbância das coenzimas NADH (nicotinamida-adenina-dinucleotídeo na forma reduzida) ou NADPH (nicotinamidaadenina-dinucleotídeo-fosfato na forma reduzida), que absorvem luz com λ máx em 340 nm. A medida dos analitos com desidrogenases ou com redutases por formação ou consumo de NAD(P)H é vantajosa porque as absortividades molares usadas para o cálculo são bem conhecidas e os métodos são praticamente livres de interferências.
Os métodos colorimétricos baseiam-se na formação de um corante que absorve luz
no espectro visível. As oxidases reagem com um substrato (analito) com formação de peróxido de hidrogênio como intermediário que, por sua vez, reage com um corante na forma leuco na presença de uma enzima peroxidase para formar um corante que pode ser medido na região visível do espectro. As Seções 17.37 e 17.38 mostram dois exemplos de uso de conjuntos de teste na análise de alimentos. A publicação da Boehringer Métodos enzimáticos de bioanálise e de análise de alimentos lista mais de 40 análises que podem ser feitas com conjuntos de teste baseados em enzimas [20].
17.18 Algumas aplicações da fluorimetria
A fluorimetria é quase sempre usada quando não existe um método colorimétrico suficientemente sensível ou seletivo para a substância de interesse. Na análise inorgânica, sua aplicação mais comum é na determinação de íons de metal como complexos orgânicos fluorescentes. Muitos dos complexos de 8-hidróxi-quinolina (oxina) fluorescem fortemente. Alumínio, zinco, magnésio e gálio, em baixas concentrações são determinados desta maneira. Alumínio forma complexos fluorescentes com o corante eriocromo azul-preto RC (pontacromo azul-preto R) e o berílio, com quinizarina. A análise de elementos não-metálicos e espécies aniônicas pode ser um problema porque muitas delas não formam derivados apropriados para a análise fluorimétrica. Os melhores métodos fluorimétricos para ametais são os de boro e selênio, que envolvem reações de formação de anéis como, por exemplo, o derivado [17A], formado na reação de condensação entre o ácido bórico e a benzoína.
Aplicações importantes na química orgânica são as determinações da quinina e das
vitaminas riboflavina (vitamina B2) e tiamina (vitamina B1). A riboflavina dissolvida em água fluoresce. A tiamina deve ser primeiramente oxidada com hexacianoferrato (III), em meio básico, a tiocromo, que fluoresce em solução de butanol. Em condições padronizadas, a fluorescência do tiocromo produzido na oxidação da vitamina B1 é diretamente proporcional a sua concentração em uma certa faixa. A fluorescência pode ser medida por referência a uma solução padrão de quinina em um colorímetro balanceado ou, diretamente, em um espectrofluorímetro [21].
Mencionamos os inibidores (quenchers) na Seção 17.3. Discutiremos aqui
brevemente a aplicação dos métodos de inibição. O princípio envolvido é a inibição da emissão de uma espécie fluorescente pelo analito de tal maneira que a intensidade da fluorescência decresce quando a concentração do analito aumenta. A maior limitação destes métodos é que eles são completamente inespecíficos e seu uso restringe-se às análises em que apenas o analito é capaz de inibir a fluorescência. O uso mais importante da inibição é provavelmente a determinação de oxigênio, uma espécie paramagnética especialmente efetiva como inibidor para moléculas com tempo de vida de fluorescência relativamente longos. Com eosina (τ ~ 10 –3 –1 s) cerca de 10 mg·l de
oxigênio produz 50% de inibição. A inibição da fluorescência é, então, um método útil para o monitoramento de baixas concentrações de oxigênio como na carga de um balão de nitrogênio “livre de oxigênio”, por exemplo.
A intensidade e a cor da fluorescência de muitas substâncias dependem do pH da
solução. Muitas substâncias são tão sensíveis ao pH que podem ser usadas como indicadores. São os indicadores fluorescentes ou luminescentes. Substâncias que fluorescem sob luz ultravioleta e mudam de cor ou que são inibidas pela mudança de pH podem ser usadas como indicadores de fluorescência em titulações ácido-base. A vantagem destes indicadores é que eles podem ser usados na titulação de soluções coloridas (às vezes intensamente coloridas) nas quais as mudanças de cor dos indicadores usuais são mascaradas. As titulações são feitas em recipientes de sílica. A
Tabela 17.6 lista alguns indicadores fluorescentes. Veremos nas Seções 17.39 e 17.40 métodos que ilustram a aplicação da fluorimetria.
Tabela 17.6 Alguns indicadores fluorescentes
Faixa
aproximada
Indicador de pH Mudança de cor
Acridina 5,2–6,6 Verde para azul-violeta
Ácido cromotrópico 3,0–4,5 Incolor para azul
Ácido 2-hidróxi-cinâmico 7,2–9,0 Incolor para verde
3,6-di-hidróxi-ftalimida 0,0–2,5 Incolor para
verdeamarelado
6,0–8,0 Verde-amarelado para verde
Eosina 3,0–4,0 Incolor para verde
Eritrosina-B 2,5–4,0 Incolor para verde
Fluoresceína 4,0–6,0 Incolor para verde
4-metil-esculetina 4,0–6,2 Incolor para azul
9,0-10,0 Azul para verde-claro