8.2 Tipos de cromatografia com fase líquida

 

8.2.1 Cromatografia líquido–sólido (LSC)

A cromatografia líquido–sólido, também chamada cromatografia por adsorção, baseia-se em interações diferenciadas entre os diversos solutos e sítios ativos fixos em um adsorvente sólido finamente dividido, usado como fase estacionária. O adsorvente pode ser colocado em uma coluna ou espalhado em uma placa (como na cromatografia em camada fina). Ele é geralmente um sólido ativo, com grande área superficial, como alumina, pó de carvão ou sílica gel, sendo esta última o adsorvente mais usado. Um aspecto prático a considerar é que adsorventes muito ativos podem levar à adsorção irreversível dos solutos: sílica gel, que é ligeiramente ácida, pode reter fortemente solutos básicos e alumina (não lavada com ácido) é básica e não deveria ser usada para a cromatografia de compostos sensíveis a bases. Adsorventes com diferentes diâmetros médios de partícula (até 5 m no caso de HPLC) podem ser obtidos comercialmente.

O solvente é extremamente importante em cromatografia líquido–sólido porque as moléculas da fase móvel (solvente) competem com as moléculas dos solutos pelos sítios polares de adsorção. Quanto mais forte for a interação entre a fase móvel e a fase estacionária, menor será a adsorção do soluto e vice-versa. A classificação dos solventes de acordo com sua capacidade de adsorção é chamada de série eluotrópica [3]. As séries eluotrópicas podem ser usadas para a determinação do melhor solvente para uma determinada separação. Pode ser necessário usar um método de tentativas, o que é feito mais rapidamente por cromatografia em camada fina do que por cromatografia em coluna. A pureza dos solventes é muito importante em cromatografia líquido– sólido porque água e outras impurezas polares afetam fortemente a eficiência da coluna e a presença de impurezas fluorescentes atrapalha muito quando se usam detectores de ultravioleta.

Em geral, os compostos que são melhor separados por cromatografia líquido–sólido são solúveis em solventes orgânicos e não são iônicos. Compostos não-iônicos solúveis em água são melhor separados por cromatografia com fase reversa ou com fase ligada.

 

8.2.2 Cromatografia líquido–líquido (partição) (LLC)

Em princípio, a cromatografia líquido–líquido é semelhante à extração com solvente (Cap. 6). Ela se baseia na distribuição, de acordo com suas solubilidades relativas, de moléculas de soluto entre duas fases líquidas imiscíveis. O meio de separação é um sólido inerte finamente dividido (sílica gel e terra diatomácea, por exemplo) que suporta uma fase líquida fixa (estacionária). A separação é feita passando-se uma fase móvel sobre a fase estacionária. A fase estacionária pode estar na forma de uma coluna empacotada, de uma camada fina sobre vidro ou de uma tira de papel.

É conveniente dividir a cromatografia líquido–líquido em duas categorias, de acordo com as polaridades relativas das fases móvel e estacionária. O termo “cromatografia líquido–líquido normal” é utilizado quando a fase estacionária é polar e a fase móvel não é polar. Neste caso, a ordem de eluição do soluto baseia-se no princípio de que os solutos não polares preferem a fase móvel e serão eluídos primeiro, e que os solutos polares preferem a fase estacionária e serão eluídos depois. Na cromatografia com fase reversa (RPC), a fase estacionária não é polar e a fase móvel é polar. A ordem de eluição dos solutos é normalmente oposta à observada na cromatografia líquido–líquido normal, isto é, os solutos polares são eluídos antes e os solutos não polares depois. A cromatografia com fase reversa é muito utilizada porque é versátil e eficaz. Isto ocorre porque praticamente todas as moléculas orgânicas são parcialmente hidrofóbicas e são, portanto, capazes de interagir com fases estacionárias não polares. Como a fase móvel é polar e freqüentemente contém água, a cromatografia com fase reversa se aplica particularmente à separação de substâncias polares insolúveis em solventes orgânicos ou que se ligam muito

fortemente a adsorventes sólidos (LSC). A Tabela 8.1 relaciona algumas fases estacionárias e fases móveis típicas usadas em cromatografia normal e com fase reversa.

Tabela 8.1 Fases móveis e estacionárias comumente usadas nas cromatografias normal e com fase reversa

 

Fases estacionárias Fases móveis

 

Normal

 

β,β′-oxidipropionitrila Carbowax (400,600, Hidrocarbonetos saturados como hexano e heptano; solventes

750 etc.) aromáticos como o tolueno e o xileno; hidrocarbonetos saturados

misturados (até 10%) com dioxano, metanol, etanol, clorofórmio,

Glicóis (etileno, dietileno) cloreto de metileno (dicloro-metano)

 

Ciano-etil-silicone

 

Fase reversa Água e misturas álcool–água; acetonitrila e misturas acetonitrila–água

 

Esqualano

 

Zipax-HCP

 

Ciano-etil-silicone

 

Embora o critério de escolha das fases estacionárias e fases móveis usadas na cromatografia líquido–líquido seja a menor solubilidade possível entre elas, a solubilidade residual da fase estacionária na fase móvel provoca a remoção lenta da fase estacionária com o fluxo da fase móvel na coluna. Para evitar este problema, a fase móvel é saturada com a fase estacionária antes do uso. Isto é feito com o auxílio de uma outra coluna, empacotada com partículas de sílica gel de 30 a 60 mesh recobertas com 30 a 40% da fase estacionária, colocada acima da coluna de cromatografia propriamente dita. Quando a fase móvel passa pela primeira coluna, fica saturada com a fase estacionária antes de atingir a segunda coluna.

Os materiais de suporte da fase estacionária podem ser, por exemplo, esferas de vidro que são relativamente inativas, ou adsorventes, semelhantes aos usados na cromatografia líquido-sólido. É importante, porém, que a superfície do suporte não interaja com o soluto porque isto pode levar a um mecanismo misto (partição e adsorção) que complica o processo cromatográfico e leva a separações pouco reprodutíveis. Por isso, deve-se usar um grande excesso de fase líquida para cobrir os centros ativos ao se utilizar adsorventes porosos com grande área superficial como suporte.

Para evitar alguns dos problemas associados com a cromatografia líquido–líquido convencional como, por exemplo, a perda de fase estacionária, pode-se ligar quimicamente a fase estacionária ao material de suporte. Esta forma de cromatografia, em que fases monoméricas e poliméricas se ligam a uma vasta gama de materiais de suporte, é chamada cromatografia com fase ligada.

Reações de silanização são muito usadas para preparar fases ligadas. Os grupos silanol ( )

da superfície da sílica reagem com cloro-silanos substituídos. Um exemplo típico é a reação de sílica com cloro-dimetil-silano que produz uma fase monomérica ligada na qual cada molécula do agente de silanização reagiu com um grupo silanol:

 

O uso de di- ou tricloro-silanos na presença de ar úmido pode levar à formação de uma camada polimérica sobre a superfície de sílica, isto é, uma fase polimérica ligada. As fases monoméricas ligadas são preferidas porque fases reprodutíveis são mais fáceis de fazer do que no caso das fases poliméricas ligadas. Além disso, a natureza das interações cromatográficas principais pode ser alterada variando-se o grupo funcional R. Em colunas analíticas de HPLC, a fase ligada mais importante é do tipo não polar C-18, em que o grupo R é octadecila. Grupos silanol que não reagiram podem adsorver moléculas polares e, portanto, afetam as propriedades cromatográficas da fase ligada, produzindo, eventualmente, efeitos indesejáveis como o derramamento (tailing) na cromatografia com fase reversa. Estes efeitos podem ser reduzidos pela inativação dos grupos silanol por reação com tricloro-silano:

 

Uma propriedade importante destas fases siloxano é sua estabilidade nas condições usuais das separações cromatográficas. As ligações siloxano só são afetadas em condições muito ácidas (pH < 2) ou muito básicas (pH > 9). Um número apreciável de fases ligadas com diâmetros adequados para HPLC está disponível comercialmente [4].

8.2.3 Cromatografia de troca iônica

O que chamamos hoje de cromatografia de troca iônica é uma versão em alta resolução da cromatografia de troca iônica que foi desenvolvida no começo dos anos 1940 para resolver os problemas da separação de terras raras e da concentração de íons transurânicos necessária para o desenvolvimento das primeiras armas nucleares. Pode-se usar equipamentos padrões de HPLC no lugar de um instrumento específico para a cromatografia de troca iônica, mas pode ser difícil escolher um sistema de solventes com as características desejáveis de eluição e absorção no ultravioleta. Cátions e ânions podem ser separados com as resinas trocadoras de íons na forma adequada (Seção 6.5). O uso de resinas trocadoras de íons convencionais na cromatografia líquida de alta eficiência, entretanto, causa problemas devido à difusão lenta no leito de resina e à baixa resistência do material, que leva à compressão do leito na coluna. O problema foi resolvido com a resina sendo ligada à superfície de esferas de vidro de diâmetro relativamente grande (30–50 m) para formar um empacotamento pelicular ou com a resina revestindo a superfície de uma micropartícula rígida para dar um empacotamento de fase reversa [5]. Colunas empacotadas com estes materiais têm alta resolução na separação de sistemas aniônicos e catiônicos. Uma vez na coluna, os íons de interesse são eluídos com uma fase móvel tamponada de força iônica crescente.

Detectores convencionais de HPLC, por exemplo, detectores de UV, podem ser usados para íons orgânicos como amino-ácidos, porém até recentemente não existiam detectores satisfatórios para íons inorgânicos. A importância de certos ânions e íons de metais estimulou a pesquisa e várias novas técnicas foram desenvolvidas. Destas, a mais utilizada aproveita mudanças da condutância do eluente durante o deslocamento do analito iônico na coluna. O que se mede é a alteração da condutância (1/resistência) e não da condutividade (1/resistividade), embora o termo “detecção de condutividade” seja habitualmente utilizado.

Uma alternativa para a detecção de condutividade é a detecção indireta de UV, que pode ser utilizada para sistemas de íons simples. Nesta técnica, o eluente contém concentração constante de um material que absorve fortemente, geralmente hidrogenoftalato de potássio ou benzoato de sódio que dão sinais intensos no ultravioleta. Os solutos iônicos são transparentes no comprimento de onda de detecção, porém, quando passam pelo detector, a absorbância diminui e picos negativos são observados. É possível registrar estes picos na forma mais comum de picos positivos invertendo-se a polaridade do registrador.

 

8.2.4 Cromatografia de exclusão por volume

O mecanismo usado para a separação de moléculas de soluto pelo tamanho ou, mais corretamente, pelo seu volume em solução, é conhecido como cromatografia de exclusão por volume (SEC). As separações de espécies solúveis em água com solventes aquosos são denominadas cromatografia com filtração em gel (GFC). As separações feitas com solventes não aquosos são chamadas de cromatografia com permeação em gel (GPC). O mecanismo é o mesmo em ambos os casos e depende do tamanho dos poros da fase estacionária relativamente ao tamanho (volume) das moléculas de soluto. Não existe interação química entre o soluto e a fase estacionária.

As fases estacionárias usadas em cromatografia com permeação em gel são materiais com poros de tamanho cuidadosamente controlados. O mecanismo principal de retenção das moléculas de soluto é a penetração diferenciada (ou permeação) de cada molécula de soluto no interior das partículas de gel. Moléculas muito grandes não penetram certas aberturas do gel e são obrigadas a atravessar a coluna acompanhando principalmente o líquido intersticial. Moléculas menores penetram melhor as partículas de gel, dependendo de seu tamanho relativo e da distribuição de poros do gel. As moléculas menores são retidas mais fortemente.

Os materiais usados originalmente como fases estacionárias eram xerogéis de poliacrilamida (Bio-Gel) e dextrana reticulada (Sephadex). Estes géis semi-rígidos, entretanto, são incapazes de suportar as pressões elevadas da cromatografia líquida de alta eficiência. As fases estacionárias utilizadas atualmente são partículas de copolímeros estireno/divinil-benzeno (Ultrastyragel, manufaturado por Waters Associates), de sílica ou de vidro poroso.

As muitas aplicações da cromatografia de exclusão por volume cobrem materiais orgânicos e inorgânicos [6]. Embora muitas destas aplicações se refiram a moléculas simples, sua maior utilidade é no estudo de biomoléculas ou de compostos de alto grau de polimerização.

O volume total V t de uma coluna de exclusão por volume é composto por três partes:

 

1. Cerca de 20% do volume total é ocupado pelo empacotamento sólido. 2. Cerca de 40% do volume total corresponde ao volume dos poros do empacotamento, V p. O

solvente e pequenas moléculas de soluto podem permear completamente estes poros e eventualmente passam por eles.

3. Os demais 40% correspondem ao volume vazio, Vv, isto é, ao espaço entre as partículas do

empacotamento.

 

Moléculas de diâmetros relativamente grandes não podem penetrar nos poros e atravessam a coluna pelo volume V v. Isto significa que para uma coluna padrão de 3000 mm por 7,8 mm, com volume total de 15 ml, todas as moléculas de diâmetros maiores do que o diâmetro médio dos poros são eluídas com cerca de 6 ml de eluente e todas as moléculas de diâmetros menores, com 12 ml de eluente. As moléculas de tamanho intermediário são eluídas com volumes intermediários do eluente. Observe que neste tipo de cromatografia o fator de capacidade, k, varia entre zero (para moléculas menores) e um (para moléculas maiores) e que o volume total útil de eluição, que está entre V p e Vv, é mais ou menos a metade do volume da coluna. Isto significa que, se não ocorrerem outros fatores de retardamento, o volume total de eluição de um determinado sistema é conhecido, mas significa, também, que o número máximo de componentes que podem ser razoavelmente separados é da ordem de doze, apenas.

Nós usamos os termos “maior” e “menor”, sem quantificá-los, porque estes conceitos gerais aplicam-se a uma faixa muito grande de tamanhos de moléculas. Um gráfico do logaritmo da

massa molecular contra o volume de eluição, como o da Fig. 8.1, pode ser feito para todos os materiais de empacotamento de exclusão por volume. Um determinado material de empacotamento, entretanto, com poros de tamanho bem definido, só pode separar efetivamente moléculas que estão em uma faixa pequena de massas. Normalmente, o fracionamento cobre a faixa de 1,5 a 2,5 ordens de magnitude, em termos de massa. Materiais para empacotamento com tamanhos de poro entre 50 Å e 106 Å são disponíveis comercialmente.

O tamanho dos poros dado pelo fabricante não é o tamanho real dos poros do material de empacotamento e sim a massa mínima de um poliestireno padrão que não é retida, isto é, o volume de exclusão limite do empacotamento. Em cromatografia de exclusão por volume é comum usar, na prática, várias colunas em seqüência para melhorar a separação. Duas ou mais colunas de mesmo limite de exclusão podem ser usadas para aumentar o número de pratos teóricos e, em conseqüência, a resolução, sem modificar a faixa de massas. Pode-se também usar colunas de tamanhos diferentes de poros para aumentar a faixa das massas separadas. Muitas das colunas comerciais são preparadas com um determinado solvente e devem ser utilizadas e guardadas com este solvente. Os eluentes mais comuns são tolueno, tetra-hidro-furano (THF), diclorometano, clorofórmio, dimetilformamida (DMF) e dimetilsulfóxido (DMSO).

Embora a cromatografia de exclusão por volume tenha muitas aplicações, seus usos principais são:

 

(a) A separação entre moléculas ou grupos de moléculas volumosas e moléculas menores. (b) A separação e caracterização de materiais poliméricos (naturais e sintéticos).

 

A separação de moléculas volumosas tem grande aplicação em biociências porque a separação entre biopolímeros e moléculas menores é, com freqüência, a primeira etapa em análises complexas. Ela pode, também, ser usada na análise química mais tradicional. Assim, por exemplo, pode-se analisar pesticidas em uma matriz complexa (gordura de galinha, por exemplo) se eles forem primeiro separados da matriz por cromatografia de exclusão por volume e, então, reinjetados em uma coluna de cromatografia com fase reversa para identificação e quantificação.

 

Fig. 8.1 Logaritmo da massa molecular contra o volume de eluição

A caracterização de polímeros é freqüentemente complicada pela falta de materiais adequados para a calibração do sistema. A separação leva a misturas de substâncias de massa molecular elevada e não a substâncias puras (monodispersas). As misturas separadas contêm compostos estruturalmente relacionados, com faixa pequena de massas. Esta distribuição de pesos moleculares ou polidispersividade dos polímeros sintéticos é muito importante e é responsável por propriedades como flexibilidade, viscosidade do polímero fundido e estabilidade do polímero. O procedimento mais comum é determinar o peso molecular médio ponderado

e o peso molecular médio

 

 

A dispersividade é dada por

 

Estes termos podem ser obtidos por cromatografia com permeação em gel se o volume de eluição for calibrado contra massas acuradas. Uma das formas de se fazer isso é usar padrões monodispersos semelhantes à amostra. É cada vez mais comum, entretanto, a calibração “universal”, baseada na relação de Mark–Houwink, uma relação linear entre o volume de solução (raio hidrodinâmico) e o logaritmo do produto da massa molecular M pela viscosidade intrínseca, ν, da substância:

 

1n v α M = volume de eluição ou v = KM

 

onde K e α são constantes que dependem principalmente do diâmetro dos poros do material utilizado e não da amostra. Estes fatores também dependem ligeiramente da temperatura e do solvente utilizado. O cálculo pode ser feito por eluição de padrões monodispersos de poliestireno, por exemplo, com o uso de um sistema de detecção duplo incluindo um detector de índice de refração e um viscosímetro diferencial. O detector de índice de difração é sensível à massa e determina a concentração c e o viscosímetro diferencial mede a viscosidade específica. Como νsp = νc, K e α podem ser determinados [7]. Uma vez estabelecida, com o auxílio de padrões de poliestireno, a relação entre o volume de eluição e a massa molecular, pode-se usar combinações de coluna e fase móvel, à escolha, para outros tipos de amostra ou pode-se usar outros detectores como, por exemplo, detectores espectroscópicos que operam no ultravioleta ou no infravermelho e são mais sensíveis do que o detector de índice de refração.

 

Escolha do sistema de cromatografia em coluna

Quando for escolher o tipo mais apropriado de coluna, procure entender as características físicas

da amostra e o tipo de informação desejada. A Fig. 8.2 mostra como selecionar um método cromatográfico para separar compostos de massa molecular relativa (RMM) < 2000. Para RMM > 2000, o melhor método é a cromatografia de exclusão por volume ou a cromatografia com permeação em gel. A previsão correta do tipo de sistema cromatográfico a ser usado nem sempre se cumpre, ela precisa ser confirmada pela experimentação. No caso de amostras complexas, nenhum método é totalmente adequado e pode ser necessário usar uma combinação de técnicas. Métodos que incluem técnicas computacionais para a otimização das condições de separação em HPLC têm sido descritos [8].