Vogel: Análise Química Quantitativa
7.6 Cromatografia em camada fina com alta resolução (HPTLC)
solventes diferentes, a separação de misturas por TLC com o
desenvolvimento em uma só direção não permite uma boa resolução dos
componentes. Este problema pode ser superado com o uso da cromatografia
em camada fina em duas dimensões. A técnica pode ser aplicada até mesmo
para compostos estruturalmente muito relacionados. Neste procedimento, a
separação é feita usando-se uma placa de TLC quadrada. A aplicação da
amostra é feita perto de um dos vértices da placa e um primeiro
desenvolvimento é feito usando um sistema de solventes (Fig. 7.4(a)).
Quando o desenvolvimento se completar (Fig. 7.4(b)), a placa é retirada da
cuba e seca. Gira-se a placa de 90° de modo a fazer com que a coluna de
manchas separadas passe a ser a linha de partida (Fig. 7.4(c)). O
cromatograma é desenvolvido novamente usando-se um segundo sistema de
solventes. O resultado (Fig. 7.4(d)) é uma separação efetiva que cobre uma
boa área da placa de TLC. Uma das grandes vantagens da cromatografia em
camada fina em duas dimensões é que é possível se obter separações
efetivas de materiais estruturalmente muito semelhantes com placas
quadradas de apenas 10 cm × 10 cm.
7.6 Cromatografia em camada fina com alta resolução (HPTLC)
A melhoria da qualidade dos adsorventes de TLC e dos procedimentos de
aplicação das amostras aumentou de tal modo o desempenho da
cromatografia em camada fina na separação de misturas, que a expressão
“cromatografia em camada fina com alta resolução (HPTLC)” foi cunhada
para descrever as separações em alta resolução que passaram a ser
possíveis. As principais melhorias que levaram à cromatografia em camada
fina com alta resolução serão sumariadas a seguir. Lembre-se, porém, que o
menor tamanho de partícula dos adsorventes também leva a menores
velocidades de desenvolvimento dos cromatogramas. Por isso, as distâncias
de eluição são menores e usam-se menores quantidades de soluto.
Fig. 7.4 Cromatografia em placa fina em duas dimensões: (a) primeiro desenvolvimento; (b) resultados da primeira separação; (c) placa rodada por 90° para o segundo desenvolvimento; (d) cromatograma final. (Reproduzido com permissão de R. C. Denney, 1982, A dictionary of chromatography, 2a Ed., Macmillan, Londres.)
Qualidade da camada adsorvente
As camadas de adsorvente para HPTLC são preparadas com sílica gel
especialmente purificada, com partículas de diâmetro médio de 3 a 5 μm e
distribuição estreita de diâmetros. A sílica gel pode ser modificada, se
necessário. Assim, existem no mercado placas com adsorventes ligados
quimicamente a compostos orgânicos (fase reversa). As camadas feitas com
estes adsorventes especiais têm cerca de 5000 pratos teóricos e são muito
mais eficientes do que a cromatografia em camada fina convencional. Isto
permite conseguir separações muito mais difíceis em menor tempo.
Métodos de aplicação da amostra
Como a camada de HPTLC tem menor capacidade, a quantidade de amostra
aplicada é menor. Tipicamente, as amostras têm volume da ordem de 100 a
200 nl, com manchas de 1,0 a 1,5 mm de diâmetro inicial. Após o
desenvolvimento por 3 a 6 cm, observam-se manchas compactas separadas cujo limite de detecção é cerca de 10 vezes melhor do que o da
cromatografia em camada fina convencional. Outra vantagem é que
manchas iniciais pequenas permitem o aumento do número de amostras que
podem ser aplicadas na mesma placa.
A colocação da amostra na camada adsorvente é um processo crítico em
HPTLC. Para o trabalho quantitativo, o instrumento mais conveniente para
colocar a amostra é um capilar de platina-irídio de volume constante (100
ou 200 nl), selado em um capilar de vidro de diâmetro maior como suporte.
A ponta do capilar é polida para dar uma superfície plana e regular com
área pequena ( 2 ∼ 0,05 mm) que, usada com um aplicador mecânico, reduz
ao mínimo os danos à superfície da placa. A colocação manual da amostra
sempre danifica seriamente a superfície.
A cromatografia em camada fina pode ser uma técnica de análise muito
trabalhosa porque muitas etapas estão necessariamente envolvidas: a
preparação da amostra, freqüentemente seguida por extração com solvente e
concentração do extrato, a aplicação da amostra, o desenvolvimento do
cromatograma e a revelação das manchas por fluorescência ou reação
química. A análise quantitativa exige, ainda, outras etapas como a raspagem
e a dissolução ou a leitura ótica. Isto fez com que ocorresse ultimamente um
grande esforço para reduzir o tempo de análise. Algumas soluções
encontradas incluem o uso de colunas de extração em fase sólida para
concentrar as amostras, seguido por revelação automatizada das manchas
para lidar com muitas amostras simultaneamente e permitir aplicações
reproduzíveis e quantitativas da amostra. Estes sistemas são particularmente
úteis no caso de muitas análises sucessivas de amostras semelhantes.
Densitômetros de varredura
Instrumentos comerciais para análise quantitativa in situ baseada em
medidas fotométricas diretas são hoje muito usados em TLC. Existem
instrumentos de feixe simples e de feixe duplo que são particularmente
importantes em HPTLC devido à alta qualidade e homogeneidade da
superfície das placas. Os densitômetros varrem as manchas uma a uma por
reflexão ou absorção de um feixe de luz. Na densitometria por refletância, um feixe móvel de luz varre o cromatograma e um detector mede a