8.3 Fase móvel, injeção da amostra e desenho da coluna

Fig. 8.2 Como escolher um sistema de cromatografia em coluna: IC = cromatografia com íons, LSC = cromatografia sólido–liquido, BPC = cromatografia com fase ligada, RPC = cromatografia com fase reversa

8.3 Fase móvel, injeção da amostra e desenho da coluna

A Fig. 8.3 mostra os detalhes de um moderno cromatógrafo de líquido:

 

1. Sistema alimentador de solvente

(a) bomba

(b) controles de pressão

(c) controles de fluxo

(d) filtro de entrada

2. Sistema de injeção da amostra

3. Coluna

4. Detector

5. Controle e visualização dos dados.

 

Consulte a literatura para descrições detalhadas da instrumentação disponível [9]. As instruções dos fornecedores devem sempre ser consultadas em relação aos detalhes de operação de cada instrumento.

 

Fig. 8.3 Características de um cromatógrafo com fase líquida moderno

 

8.3.1 Fase móvel Uma separação cromatográfica efetiva depende de diferenças na interação entre os solutos e as fases móvel e estacionária. Em cromatografia com fase líquida, a escolha e as possibilidades de variação da fase móvel são críticas para a eficiência ótima. Antes, entretanto, de considerar teoricamente a escolha do solvente, eis alguns comentários gerais. Os solventes usados em cromatografia líquida de alta eficiência são geralmente muito caros. Para garantir a repetitividade do desempenho, as impurezas dos solventes, inclusive água, no caso de solventes orgânicos devem estar ao nível de traços. Se o sistema usa um detector de UV, até mesmo traços de substâncias que absorvem são inaceitáveis e elas devem ser totalmente removidas. Partículas existentes nos solventes devem ser também removidas porque com o uso prolongado elas se depositam na bomba e no injetor, e bloqueiam a coluna.

Embora seja sempre possível purificar convenientemente os solventes normais de laboratório, o processo é lento e, por isso, muitos usuários preferem comprar os reagentes de HPLC comerciais, inclusive água. Estes reagentes podem ser usados diretamente, sem que seja necessária nova etapa de purificação, porém, é sempre necessário degasá-los imediatamente antes do uso. O custo dos solventes próprios para HPLC é uma fração importante do custo de manutenção de um laboratório que usa a cromatografia líquida de alta eficiência e, por isso, a reciclagem dos solventes é cada vez

mais utilizada (Fig. 8.4). Os sistemas de reciclagem são válvulas controladas por computador colocadas após o detector. Elas garantem o retorno do solvente que não contém analitos que absorvem no ultravioleta ao reservatório e o descarte do solvente que contém espécies que absorvem. Os fabricantes de sistemas de reciclagem garantem que o custo inicial da reciclagem é rapidamente recuperado em conseqüência do menor consumo de solvente e do menor descarte.

Uma fase móvel adequada é vital em HPLC e, por isso, vale a pena examinar os fatores que determinam sua escolha. O poder de eluição da fase móvel é determinado por sua polaridade, pela polaridade da fase estacionária e pela natureza dos componentes da amostra. No caso de separações com fase normal, o poder de eluição aumenta com o aumento da polaridade do solvente. Nas separações com fase reversa, o poder de eluição diminui com o aumento da polaridade do solvente. A cromatografia com fase reversa é muito popular, em parte, por causa do tipo de material no qual se usa a cromatografia com fase líquida, mas também porque existem muitas vantagens no uso de fases móveis polares como água e metanol. Em comparação com as fases apolares, as fases polares são mais baratas e a purificação é mais fácil. Além disso, elas são menos afetadas por pequenas quantidades de impurezas e são menos tóxicas.

Fig. 8.4 Reciclar o solvente é uma idéia cada vez melhor

Não existe maneira adequada de classificar todos os solventes comuns em termos de polaridade. A maneira mais prática talvez seja a classificação de Snyder, que foi aplicada a 81 solventes [3]. A cada solvente é dado um índice de polaridade P, na base de resultados de cromatografia com fase

gasosa (Tabela 8.2). A seguir, mais três parâmetros são avaliados: a capacidade como acceptor de prótons, como doador de prótons e o momento de dipolo elétrico. Com estas informações, os solventes são separados em oito grupos de características semelhantes. Este procedimento é mais satisfatório do que o uso das séries eluotrópicas baseadas em um único parâmetro 0 conhecido

como parâmetro de força do solvente (força do eluente), também listado na Tabela 8.2 para fins de comparação. Os índices de polaridade variam entre 2 e 10,2 e, em princípio, qualquer valor entre estes limites pode ser obtido com a combinação apropriada de dois ou mais solventes.

Outras propriedades dos solventes que devem ser consideradas são o ponto de ebulição, a viscosidade (viscosidades baixas geralmente levam a melhor eficiência cromatográfica), compatibilidade com o detector, flamabilidade e toxidez. Muitos dos solventes comuns de cromatografia líquida de alta eficiência são inflamáveis e alguns são tóxicos e, por isso, é recomendável que instrumentos de HPLC sejam usados em laboratórios bem ventilados, se possível em capela ou sob uma coifa eficiente.

Solventes especialmente purificados para HPLC, livres de impurezas que absorvem no ultravioleta e de partículas sólidas estão disponíveis comercialmente. Se houver necessidade de usar solventes menos puros, eles devem ser purificados porque impurezas que absorvem fortemente no ultravioleta afetam o detector e porque impurezas com polaridade maior do que a do solvente (por exemplo, traços de água ou etanol, comumente adicionados ao clorofórmio como estabilizadores) podem influenciar a separação. É importante, também, remover o ar dissolvido e eventuais bolhas de ar na coluna, que são uma das causas de problemas na bomba e no detector durante o uso. Para evitar estes problemas pode-se degasar a fase móvel antes do uso, colocando a fase móvel em vácuo ou aquecendo sob ultra-som. Existem, na literatura, compilações de propriedades de solventes úteis para HPLC [10].

Não existem regras fixas para escolher a melhor fase para uma dada separação, a não ser “o semelhante separa o semelhante”. O analista deve guiar-se pela literatura e pelas informações fornecidas pelos fabricantes.

 

8.3.2 Otimização da fase móvel

Como o parâmetro mais fácil de alterar quando se deseja obter a melhor separação em cromatografia com fase líquida é a composição da fase móvel, muitos estudos já foram feitos para tornar esta operação mais efetiva. No caso de separações relativamente simples, é sempre possível escolher uma mistura de solventes para ser usada durante todo o experimento. Esta operação isocrática é mais simples do que os métodos de gradiente usados na eluição de sistemas mais complexos descritos adiante. O sistema de solventes pode ter mais do que um componente, chegando, às vezes, a quatro. A melhor maneira de definir estes sistemas de solventes complexos é

usar um triângulo para sistemas ternários e um tetraedro para sistemas quaternários (Fig. 8.5). A composição de qualquer mistura é dada por um ponto no interior da figura. O problema é localizar o ponto que dá a melhor separação de uma dada mistura. Alguns métodos para resolver esta questão foram desenvolvidos. Eles se baseiam em algoritmos de simplex, nos quais uma seqüência de experimentos é feita e a composição é ajustada até que se encontre o conjunto ótimo de condições.

Tabela 8.2 Propriedades de solventes comuns

 

Índice de Forca de Índice de Corte no Viscosidade em Ponto de

polaridade ebulição refração UV 20°C eluição

(nm) –2 (mNsm) (°C)

 

Fluoro-alcanos <-2 –0,25 1,27–1,29 200 0,4–2,0 50–174

 

Ciclo-hexano 0,04 –0,2 1,423 200 0,90 81

 

n-Hexano 0,1 0,01 1,372 195 0,33 69

 

1-Cloro-butano 1,0 0,26 1,400 220 0,42 78

 

Tetracloreto de 1,6 0,18 1,459 265 0,97 76,8

carbono

 

2-Propiléter 2,4 0,28 1,367 210 0,38 68

 

Tolueno 2,4 0,29 1,494 280 0,59 110

 

Cloro-benzeno 2,7 0,30 1,523 290 0,80 132

 

Cloro-benzeno 2,7 0,30 1,523 290 0,80 132

 

Dietiléter 2,8 0,38 1,352 205 0,23 35

 

Dicloro-metano 3,1 0,42 1,421 233 0,44 40

 

Tetra-hidro- 4,0 0,45 1,404 238 0,55 66

furano

 

Clorofórmio 4,1 0,40 1,444 245 0,58 61,2

 

Etanol 4,3 0,88 1,359 207 1,20 78,5

 

Acetato de etila 4,4 0,58 1,370 255 0,45 77

 

1,4-Dioxano 4,8 0,56 1,420 216 1,54 101,3

 

Metanol 5,1 0,95 1,326 210 0,60 64,7

 

2-Propanona 5,1 0,56 1,357 330 0,33 56,2

 

Acetonitrila 5,8 0,65 1,342 190 0,37 82,0

 

Nitro-metano 6,0 0,64 1,380 380 0,70 101

 

Ácido acético 6,0 alta 1,370 230 1,28 117,9

 

Etilenoglicol 6,9 1,11 1,429 235 19,9 182

Dimetilsulfóxido 7,2 0,62 1,476 270 2,0 189

 

Água 10,2 alta 1,333 190 1,002 100

 

Estes métodos seqüenciais ou iterativos podem exigir um grande número de cromatogramas. Em determinadas circunstâncias eles podem ser substituídos por métodos preditivos, onde os resultados obtidos em um número relativamente pequeno de experimentos são processados em um programa de computador. O primeiro destes experimentos é, usualmente, um experimento de eluição por gradiente de 0 a 100% de cada um dos pares de solventes a serem utilizados. Isto define uma linha (no caso de sistemas ternários), ou um plano (no caso de sistemas quaternários), que contém a composição desejada. Existem programas de computador comerciais para este fim e o processo pode ser completamente automatizado se usado com sistemas de injeção automática. Estes sistemas de otimização têm sido aplicados principalmente à cromatografia com fase reversa. As combinações mais comuns de solventes incluem água (ou uma solução tampão), W, metanol, M, acetonitrila, A, e tetra-hidro-furano, T. No caso de análises repetitivas, os métodos de otimização de solvente permitem, com freqüência, encontrar um solvente capaz de substituir as técnicas de eluição por gradiente. A eluição por gradiente é, geralmente, mais lenta do que a operação isocrática, quando se leva em conta o tempo necessário para a reequilibração após cada alteração de composição do solvente.

 

Fig. 8.5 Sistemas ternários e quaternários

 

8.3.3 Métodos de gradiente

O uso de gradientes na eluição permite freqüentemente a separação de solutos que não podem ser separados por uma operação isocrática, mesmo com solventes mistos. Ela é especialmente eficiente quando os componentes da amostra diferem muito em polaridade.

No caso de sistemas de baixa pressão, o gradiente é feito com solventes colocados em reservatórios diferentes que alimentam uma câmara de mistura de onde a mistura é bombeada para a coluna. Os instrumentos mais modernos usam válvulas programadas no tempo controladas por um microprocessador [11]. Isto melhora a resolução dos cromatogramas, com redução do tempo de corrida e aumento da sensibilidade. Os picos que em uma corrida isocrática teriam tempos de retenção muito grandes e talvez uma cauda apreciável são eluídos mais rapidamente.

Muitos cromatógrafos comerciais têm sistemas de manuseio de líquidos que podem misturar dois ou mais solventes em proporções crescentes de 0 a 100% de um dos componentes, gerando

um perfil de composição em relação ao tempo (Fig. 8.6). Este perfil, que pode ser convexo, côncavo ou linear, cumpre o mesmo papel da programação de temperatura na cromatografia com fase gasosa e permite a separação de picos muito próximos em uma parte do cromatograma sem alterar a resolução dos picos em outras partes. Existem, porém, limitações técnicas. Se um dos solventes dá uma resposta apreciável no detector, digamos, absorção de luz em um detector de ultravioleta, então a geração de um gradiente com este solvente provocará o deslocamento da linha de base. A coluna precisa, também, de tempo para voltar à composição inicial da mistura de solventes cada vez que uma nova corrida é feita. Costuma-se fazer uma corrida com gradiente como branco entre duas amostras sucessivas, para prevenir a possiblidade de ocorrência de picos de falsos positivos. Isso tudo faz com que as eluições por gradientes pareçam mais lentas do que os tempos de retenção publicados. A seleção do perfil correto de composição do solvente também pode consumir muito tempo, outra semelhança com a programação de temperatura em cromatografia com fase gasosa. Gradientes de força de tampão em soluções em água ou solventes que contêm água também são usados em cromatografia iônica.

Fig. 8.6 Separação de 2,4-dinitro-fenil-hidrazonas de aldeídos com fase reversa e programação de solvente

 

8.3.4 Introdução do solvente e injeção da amostra

Embora uma certa variedade de sistemas diferentes sejam usados em HPLC, o mais popular é a bomba de controle alternado, que manipula volumes pequenos, tem fluxo constante e pode fornecer taxas controladas de fluxo da ordem de 1 a 15 ml·min–1 contra uma coluna que exerce pressões de até 7250 psi (50 MPa). Sua popularidade pode ser entendida se olharmos mais de perto suas características. A parte mais importante da bomba é a cabeça, que contém um pistão e uma câmara de solvente de volume muito pequeno (10 a 50 μl) com duas válvulas de controle em linha

(Fig. 8.7).

Quando o pistão se retira da câmara, a válvula 1 se abre, permitindo a entrada da fase móvel, e a válvula 2 se fecha, impedindo o retorno do líquido da coluna. Quando o pistão reentra na câmara, a válvula 1 se fecha, impedindo o fluxo inverso para o reservatório de solvente, e a válvula 2 se abre permitindo a passagem da fase móvel para a coluna. O processo se repete com a velocidade necessária para produzir o fluxo desejado na coluna. (No caso de uma cabeça com volume igual a 10 l, isto corresponde a 100 vezes por minuto.) Uma cabeça única, porém, produz um fluxo pulsado porque a fase móvel penetra a coluna de acordo com o movimento alternado do pistão e isto pode causar ruído no detector.

 

Fig. 8.7 Cabeça de bomba de válvula dupla e fluxo constante

O ruído do fluxo pode ser reduzido com uma bomba de ciclo tão rápida, 20 ciclos por segundo, por exemplo, que o tempo de resposta do detector não é suficiente para registrar a flutuação. A velocidade de fluxo é controlada pelo aumento da distância a ser percorrida pelo pistão. A maneira mais comum de reduzir o ruído do fluxo, entretanto, é usar uma bomba de duas cabeças que operam fora de fase (180°) de modo que quando uma estiver se enchendo de solvente a outra está transferindo solvente para a coluna. Este tipo de bomba é muito confiável e seguro. A bomba pode ser construída com materiais relativamente inertes de modo que a fase móvel só entra em contato com o aço inoxidável, com o rubi de que são feitas as esferas das válvulas e com o material inerte dos selos ou descansos das válvulas. Uma outra vantagem é que, como o volume morto é muito pequeno, estas bombas podem ser usadas para a programação de solventes.

A faixa de velocidades de fluxo que pode ser obtida com uma bomba a pistão é uma característica cada vez mais importante no desenho dos equipamentos, principalmente devido às baixas velocidades necessárias para a cromatografia com microdiâmetros (narrow bore) e a cromatografia capilar. Estes sistemas exigem fluxos entre 1 e 500 μl·min–1, onde as bombas a pistão não são confiáveis. Pode-se usar gás comprimido, porém, neste caso, não se consegue fluxos constantes. Bombas de membrana são outra alternativa. Uma proposta mais radical, atualmente sob desenvolvimento, usa o efeito eletrosmótico da fase móvel para produzir baixos fluxos controlados acuradamente [12].

 

Sistema de injeção de amostras

A introdução da amostra é geralmente feita de duas maneiras: por injeção com seringa ou com válvula de amostragem. Os septos de injeção permitem a introdução da amostra com uma seringa de alta pressão que atravessa um septo auto-selante feito com um elastômero. Um dos problemas associados com este tipo de injeção é o arrasto de material pela fase móvel que entra em contato com o septo, que pode levar a picos falsos na análise. Em HPLC, a injeção com seringas é mais problemática do que em cromatografia com fase gasosa.

Embora os problemas associados aos injetores de septo possam ser contornados com o uso de injeção por fluxo interrompido, sem septo, os dispositivos mais utilizados atualmente em

instrumentos comerciais são as válvulas de amostragem de pequeno volume (Fig. 8.8), que permitem a introdução de amostras, de forma reprodutiva, em colunas pressurizadas, sem interrupção significativa do fluxo da fase móvel. A amostra é colocada, na pressão atmosférica, no lado externo da válvula e introduzida na corrente de fase móvel pela rotação apropriada da válvula. O volume de amostra pode variar entre 2 μl e mais de 100 μl simplesmente com a mudança da válvula ou com válvulas especiais de volume variável. Podem ser usados injetores automáticos de amostra que permitem a operação desassistida do instrumento (durante a noite, por exemplo). A válvula de injeção é preferida para o trabalho quantitativo devido a sua maior precisão em relação à injeção com seringa.

 

8.3.5 Coluna

As colunas mais usadas são feitas de tubos de aço inoxidável de diâmetro interno controlado, com dimensões entre 10 e 30 cm de comprimento e 4 a 5 mm de diâmetro interno. A fase estacionária, ou empacotamento, é retida por filtros de aço inoxidável com poros de 2 μm ou menos, colocados em cada extremidade.

Os empacotamentos usados atualmente em HPLC são formados por partículas rígidas pequenas com distribuição estreita de tamanho. Os empacotamentos são de três tipos:

 

(a) Esferas porosas, poliméricas, baseadas em copolímeros estireno-divinil-benzeno. Este tipo é

muito usado em cromatografia de troca iônica e cromatografia de exclusão por volume (Seção 8.2). Em muitas aplicações analíticas, elas são substituídas por empacotamentos na base de sílica, mais eficientes e mais estáveis mecanicamente.

(b) Camadas porosas de esferas (diâmetro 30–55 μm) feitas com uma camada fina (1 a 3 μm) de

sílica, de sílica modificada ou de outro material depositado sobre uma esfera inerte (vidro). Esses empacotamentos com películas porosas são ainda usados em algumas aplicações que envolvem troca de íons, mas seu uso geral em HPLC diminuiu com o desenvolvimento de empacotamentos com micropartículas porosas.

(c) Partículas porosas de sílica (diâmetro < 10 μm, com distribuição apertada de diâmetros), usadas

como empacotamento em quase todas as colunas comercialmente importantes. Este tipo de empacotamento dá resultados de HPLC consideravelmente melhores do que os empacotamentos de película porosa, têm maior capacidade e a análise é mais rápida.

 

Fig. 8.8 Alça de amostragem de uma válvula de microvolume

O desenvolvimento de fases ligadas (Seção 8.2) para uso em cromatografia em colunas de sílica gel foi muito importante. A coluna C-18, por exemplo, permite a separação de misturas moderadamente polares e é muito usada na análise de produtos farmacêuticos, drogas e pesticidas.

O procedimento escolhido para o empacotamento das colunas depende principalmente da resistência mecânica do material e do diâmetro das partículas. Partículas de diâmetro > 20 μm podem ser empacotadas a seco. Partículas com diâmetros < 20 μm têm que ser empacotadas com as partículas em suspensão em um solvente apropriado, colocadas na coluna sob pressão. O procedimento adequado para o empacotamento com suspensões pode ser encontrado na literatura [13]. Muitos analistas, porém, preferem adquirir colunas de HPLC comerciais, cujas características podem ser encontradas nos catálogos apropriados.

O tamanho da coluna pode afetar a resolução de uma determinada amostra porque quanto maior a coluna maior é o número de pratos teóricos. Pode afetar também a velocidade da análise e este é o fator mais relevante na escolha do tamanho da coluna. Os tamanhos padronizados variam de acordo com o fabricante. Os tamanhos mais comuns são 300, 250, 150, 125, 100 e 75 mm. As colunas mais longas são ditas colunas normais e as mais curtas, colunas de alta velocidade.

 

Efeito do tamanho da coluna

Para alcançar uma dada eficiência, 12500 pratos teóricos, por exemplo, pode-se usar uma coluna de 250 mm contendo um empacotamento de 5 μm de diâmetro. A mesma eficiência poderia ter sido obtida com uma coluna de 150 mm empacotada com partículas de 3 μm. Reduzindo o diâmetro das partículas à metade dobra-se a eficiência. Para a mesma velocidade linear na coluna, a velocidade da análise aumenta de 250/150. Como, porém, as partículas menores têm velocidade linear maior, o aumento de velocidade na coluna menor seria 250/150 × 5/3 = 3 vezes maior para a mesma resolução. A coluna empacotada com as partículas de diâmetro menor é mais cara do que a coluna normal de 5 μm.

 

Efeito do diâmetro

Colunas analíticas de vários diâmetros estão disponíveis comercialmente. Os diâmetros internos variam usualmente entre 4,6 mm e < 0,2 mm (200 μm). As colunas preparativas de LC podem ter diâmetros internos maiores do que 50 mm, porém só consideraremos as colunas analíticas. Geralmente, quanto maior for o diâmetro da coluna, maior a quantidade de material que suporta e, portanto, maior a carga de amostra que deve ser injetada. O inverso também é verdade, mas quando o diâmetro da coluna é menor, outros fatores interferem e tornam as colunas de menor diâmetro (colunas estreitas) mais interessantes, pelo menos em teoria.

Considere duas colunas com diâmetros internos 4,6 mm e 2,1 mm (colunas estreitas), empacotadas com o mesmo material, com o mesmo número de pratos teóricos e mesma eficiência. Para manter a mesma velocidade linear nas duas colunas, a velocidade de fluxo deve ser menor na coluna mais estreita por um fator igual a ∼5 (4,8, para ser exato). Isto significa que menos solvente precisa ser utilizado para uma dada separação, reduzindo consideravelmente o custo de operação do sistema. Uma segunda vantagem importante é que uma determinada substância elui em um volume menor de solvente; logo, no caso da maior parte dos detectores, cuja resposta depende da concentração, a altura do pico aumenta por um fator de ∼5 e o limite de detecção diminui pelo mesmo fator. As vantagens das colunas estreitas levaram a muitas pesquisas sobre o desempenho de colunas de diâmetros de até 0,1 mm (100 μm). Pequenos diâmetros, entretanto, exigem condições muito mais difíceis de obter no sistema, já que requerem velocidades de fluxo muito baixas e volumes mortos extremamente pequenos.

Embora não exista consenso para descrever as diversas colunas, tem sido sugerido [14] usar o termo “microdiâmetro” (microbore) para colunas de diâmetro interno entre 2,0 e 0,5 mm e o termo “microcoluna” para diâmetros inferiores a 0,5 mm. Estas últimas são ainda subdivididas em capilares empacotados (40 a 300 μm) e capilares vazios (3 a 50 μm). As colunas vazias (OT) são fabricadas com sílica fundida revestida e são mecanicamente idênticas às colunas capilares de cromatografia com fase gasosa. Quando este livro foi escrito, poucos sistemas comerciais eram capazes de usar colunas com microdiâmetros ou microcolunas, principalmente porque o sistema tem que ser desenhado cuidadosamente para minimizar os volumes mortos e porque as bombas e detectores têm que operar em velocidades muito baixas (até 1 μl·min –1). Embora existam alguns problemas mecânicos com o uso dessas colunas, se eles puderem ser resolvidos, poderia ser possível separar misturas que requerem mais de 100000 pratos teóricos em menos de 30 minutos, usando volumes muito pequenos de fase móvel e ainda ter alta sensibilidade.

Finalmente, a vida útil de uma coluna analítica pode ser prolongada com a colocação de uma coluna de guarda, uma coluna pequena colocada entre o injetor e a coluna de HPLC para protegê-la de danos ou da perda de eficiência decorrentes da passagem de partículas ou substâncias que absorvem fortemente em amostras ou em solventes. Ela pode ser também usada para saturar o solvente de eluição com a fase estacionária solúvel. Colunas de guarda podem ser empacotadas com fases estacionárias microparticuladas ou com esferas com camada porosa. Estas últimas são mais baratas e fáceis de usar do que as fases microparticuladas, mas têm menor capacidade e, por isso, devem ser trocadas com mais freqüência.