Vogel: Análise Química Quantitativa
9.5 Procedimentos quantitativos
Medir a área de um pico pode ser difícil quando ocorre superposição de picos no
cromatograma. Este problema, entretanto, pode ser superado com o uso de técnicas de derivação que dão a primeira ou a segunda derivada dos cromatogramas. A Seção 17.13 explica o uso de procedimentos de derivação nos métodos espectroanalíticos. Muitos programas de computador também executam esta operação, indicando também o grau de superposição dos picos.
9.5 Procedimentos quantitativos
As medidas quantitativas dependem da correlação entre a área dos picos e a quantidade ou concentração dos solutos em várias amostras. Entretanto, áreas iguais para solutos diferentes não indicam necessariamente que a mesma quantidade das substâncias está presente na amostra. Isto ocorre porque a área dos picos (ou os valores de integração no registrador) dependem da resposta do detector, que é característica de cada substância.
Na forma mais simples, toma-se na quantificação uma série de padrões da
substância pura e constrói-se uma curva de calibração contra a qual se compara a área da curva correspondente ao analito de interesse, após diluir, se necessário. Obtém-se, assim, a concentração desconhecida. Este procedimento simples, entretanto, está sujeito a erros, alguns humanos e outros instrumentais. Por isso, é mais comum usar as técnicas de normalização das áreas, de padrões internos ou de adição padrão.
Normalização das áreas
Na técnica da normalização das áreas, obtém-se a composição da mistura pela expressão da área de cada pico como uma percentagem da área total dos picos do cromatograma. Deve-se corrigir as áreas dos picos para quaisquer variações significativas da sensibilidade do detector em relação aos diferentes componentes da mistura (Seção 9.9).
Padrões internos A área e a altura dos picos cromatográficos são afetadas pela quantidade de amostra e, também, pelas flutuações de vazão do gás de arrasto e pelas temperaturas da coluna e do detector, isto é, por alterações nos fatores que influenciam a sensibilidade e a resposta do detector. O efeito destas variações pode ser eliminado pelo uso da técnica do padrão interno, na qual se adiciona uma pequena quantidade conhecida de uma substância de referência à amostra a ser analisada, antes da injeção na coluna. Para que as substâncias usadas como padrão interno sejam efetivas (Seção 4.5) algumas condições devem ser satisfeitas:
(a) Elas devem dar um pico completamente resolvido cuja eluição ocorra nas
vizinhanças dos componentes que vão ser analisados.
(b) A área ou a altura do pico correspondente deve ser semelhante à dos picos dos
componentes que vão ser analisados.
(c) Elas devem ser quimicamente semelhantes às substâncias que vão ser analisadas,
mas não devem estar presentes na amostra original.
Adiciona-se uma quantidade constante do padrão interno a um volume conhecido de várias misturas sintéticas que contêm quantidades variadas e conhecidas dos componentes a serem determinados. Faz-se a cromatografia das misturas resultantes e obtém-se uma curva de calibração fazendo o gráfico da percentagem do componente na mistura contra a razão entre a área do pico do componente e a área do pico do padrão. A análise da mistura desconhecida é feita pela adição da mesma quantidade de padrão interno ao volume especificado da mistura. A concentração do soluto é obtida na curva de calibração a partir da razão observada entre as áreas dos picos. Se o padrão interno utilizado for eficiente, este método é, provavelmente, o mais preciso para uso na cromatografia com fase gasosa quantitativa. A concentração de etanol em amostras de sangue, por exemplo, é determinada usando-se 2-propanol como padrão interno.
Adição padrão
Cromatografa-se a amostra antes e depois da adição de uma quantidade exatamente conhecida do componente que se deseja determinar e calcula-se seu peso na amostra a partir da razão entre as áreas do pico dos dois cromatogramas. A adição padrão é muito útil na análise de misturas complexas quando não se consegue obter um padrão interno adequado. Procedimentos de adição padrão são muito usados nas análises químicas e explicações mais detalhadas desta técnica podem ser encontradas nas Seções 13.39, 15.15 e 18.11.