8.4 Escolha do detector

Em HPLC, a função do detector é monitorar o fluxo da fase móvel em um ponto da coluna. O problema da detecção é mais complicado em HPLC do que em cromatografia com fase gasosa. Na cromatografia com fase líquida não há o equivalente a um detector universal de ionização por chama como na cromatografia com fase gasosa. Os detectores disponíveis podem ser divididos em duas grandes classes:

 

Detectores de propriedades macroscópicas medem as alterações de propriedades físicas

provocadas pelo soluto na fase móvel como, por exemplo, o índice de refração e a

condutividade. Embora de uso geral, tendem a ter pouca sensibilidade e faixa limitada de

aplicação. São geralmente afetados por pequenas alterações de composição da fase móvel, o que

impede seu uso na eluição por gradientes.

Detectores de propriedades do soluto podem ser detectores epectrofotométricos, eletroquímicos

ou de fluorescência. Os detectores respondem a uma dada propriedade física ou química do

soluto e são, idealmente, independentes da fase móvel. Na prática, raramente se consegue esta

última condição, porém a discriminação do sinal é normalmente suficiente para permitir a

operação com mudança da composição do solvente, isto é, a eluição por gradiente. Estes

detectores são geralmente muito sensíveis (cerca de 1 para 109 pode ser obtido com detectores

de ultravioleta ou de fluorescência) e têm uma larga faixa de resposta linear, no entanto, devido

a sua seletividade, mais de um detector pode ser necessário para atender as necessidades das

análises. Alguns detectores comerciais têm um certo número de opções de modo de detecção em

uma só unidade, por exemplo o sistema “3D” da Perkin-Elmer, que combina absorção UV,

fluorescência e detecção condutimétrica.

 

Algumas das características importantes dos detectores são:

 

Sensibilidade freqüentemente expressa como a concentração equivalente de ruído, isto é, a

concentração de soluto, Cn, que produz um sinal igual ao nível de ruído do detector. Quanto

menor o valor de C n de um soluto, mais sensível é o detector para este soluto. Faixa linear é a faixa de concentração na qual a resposta do detector é diretamente proporcional à

concentração do soluto. A análise quantitativa é mais difícil fora da faixa linear de

concentrações.

Tipo de resposta isto é, se o detector é geral ou seletivo. Um detector geral responde a todos os

constituintes da amostra. Um detector seletivo só responde a determinados componentes.

Embora a resposta do detector não seja independente das condições de operação, temperatura da

coluna ou velocidade de fluxo, por exemplo, os detectores seletivos têm vantagens se a resposta

não varia muito com pequenas alterações destas condições.

Muito esforço foi posto no desenho e construção de detectores de HPLC. Uma revisão da literatura [15] lista pelo menos 30 tipos diferentes de sistemas de detecção, baseados em quase todas as técnicas espectroscópicas, incluindo RMN e EPR, além de outros sistemas baseados em técnicas não espectroscópicas. Em cada caso, são postas em evidência a maior sensibilidade, seletividade ou compatibilidade com colunas capilares ou de microdiâmetro, porque essas características são críticas para o desenho dos detectores. A maior parte dos detectores de HPLC são espectroscópicos

(Tabela 8.3), sendo os sistemas eletroquímicos o segundo maior grupo, seguindo-se um certo número de técnicas especiais, para aplicações específicas.

 

8.4.1 Detectores de ultravioleta

O detector de HPLC mais utilizado é o detector de absorção no ultravioleta. Este tipo de detector mede a quantidade de luz UV/visível absorvida durante a passagem do efluente por uma pequena célula de fluxo colocada no caminho ótico do feixe de radiação. A principal característica desses detectores é a alta sensibilidade (limite de detecção da ordem de 1 × 10 –9 –1 g·ml, para compostos de alta absortividade) e, como eles medem propriedades do soluto, são relativamente insensíveis a variações da temperatura e da velocidade de fluxo do efluente. O detector de ultravioleta é, em geral, apropriado para experimentos de gradiente de eluição porque muitos dos solventes usados em HPLC não absorvem apreciavelmente nos comprimentos de onda usados para monitorar o efluente. Bolhas de ar na fase móvel atrapalham o experimento porque causam variações bruscas no cromatograma, mas isto pode ser minimizado por degasagem da fase móvel antes do uso (por exemplo, com vibração ultra-sônica). Existem detectores comerciais de feixe simples e de feixe

duplo (Fig. 8.9). Embora os detectores originais trabalhassem em uma ou duas freqüências (254 e 280 nm), atualmente alguns fabricantes comercializam detectores que cobrem a faixa 210–800 nm, tornando a detecção mais seletiva.

Embora detectores de comprimentos de onda seletivos sejam muito usados em HPLC, eles estão sendo substituídos rapidamente por detectores compostos por conjuntos de diodos e sistemas de transferência de carga que podem analisar o espectro total várias vezes por segundo. Nestes detectores, usa-se luz policromática, que passa pela célula de fluxo do HPLC. A radiação emergente é desviada por uma rede de difração para o conjunto de diodos detectores, uma série de mais de mil semicondutores sensíveis: fotodiodos ou sistemas de transferência de carga. Cada unidade do detector recebe uma faixa diferente de comprimentos de onda e é lida várias vezes por segundo por um microprocessador. O espectro resultante da soma das leituras pode ser apresentado em um visor e quando diferentes compostos passam pela célula de fluxo, as mudanças de intensidade e natureza do espectro são registradas. Uma característica importante do detector multicanal é que ele pode ser programado para registrar mudanças nos comprimentos de detecção em pontos específicos do cromatograma. Isto permite que se faça a “limpeza” do cromatograma, isto é, o reconhecimento de picos interferentes devido a compostos que não interessam ao analista.

Tabela 8.3 Detectores usados na cromatografia líquida de alta eficiência

 

Nome Limite de detecção Gradiente Aplicação

aproximado (μg ml–

1)

 

Absorbância no UV-visível –4 10 S Seletivo, versátil

 

Fluorescência –5 10 S Seletivo, número

limitado de

compostos

 

Quimiluminescência –5 2 × 10 S Seletivo, grupos

restritos de

compostos

 

Fluorescência induzida por laser baixo S Seletivo, faixa

limitada de

compostos

 

Espalhamento de luz de laser em ângulo 10 N Espécies com alto

pequeno (LALLS) peso molecular

 

Infravermelho por transformadas de Fourier 1 S Seletivo, versátil

(FT-IR)

 

Condutividade –2 10 S/N Íons e espécies

ionizáveis

 

Amperometria –5 10 N Seletivo, espécies

oxidáveis ou

redutíveis

 

Índice de refração –2 10 N Detector universal

 

Espectrometria de massas –5 10 S Detector universal

 

Atividade óptica –4 10 N Centros quirais 8.4.3 Outros detectores espectroscópicos

ICP-MS –3 2,5 × 10 S Espécies metálicas

 

Fig. 8.9 Detector de ultravioleta com feixe duplo

 

8.4.2 Detectores de luminescência

Pode-se usar a fluorescência de um certo número de compostos e detectores convencionais de fluorescência. Estes detectores são seletivos e sensíveis a materiais fluorescentes ou que se tornam fluorescentes por derivatização depois da coluna. Como nesta técnica a intensidade da emissão é diretamente proporcional à intensidade da excitação, alguns sistemas já usam fontes a laser em substituição das antigas lâmpadas de xenônio. Estes sistemas são conhecidos como detectores de fluorescência induzida por laser (LIF). Um deles usa um laser de argônio no dobro da freqüência operado em 257 nm. A intensidade extremamente alta e a resolução espacial dos laseres fazem com que eles sejam apropriados para uso com sistemas capilares ou de microdiâmetro, levando a alta sensibilidade e limites de detecção extremamente baixos para muitos compostos. Vários autores afirmam terem obtido limites de detecção entre 3 × 10–18 –18 e 10 × 10 moles para nucleotídeos. A aplicação de detectores de fluorescência tornou-se mais ampla com o desenvolvimento de técnicas de derivatização de compostos não fluorescentes ou fracamente fluorescentes, antes e depois de passar pela coluna (Seção 8.7).

Dois fatores limitam a detecção por fluorescência. Em primeiro lugar, o composto de interesse deve ser fluorescente. Em segundo lugar, mesmo que ele seja fluorescente, a emissão pode ser coberta por emissões mais intensas de impurezas da amostra ou do solvente. Estes problemas levaram ao desenvolvimento da detecção por quimioluminescência, onde a energia de excitação é química e não espectroscópica. Muitos sistemas misturam o eluente da cromatografia, após a passagem pela coluna, com uma solução de luminol ou peróxi-oxalato. A mistura é, então, colocada em um fluorímetro comercial onde a fonte de excitação foi apagada ou bloqueada. Outros sistemas usam reagentes imobilizados. Os limites de detecção são cerca de dez vezes menores do que os da fluorescência, porém a seletividade é alta. A maior parte dos sistemas estudados até agora são de interesse biológico ou farmacológico[17], mas traços de metais, inclusive cobalto, também têm sido determinados.

É conveniente incluir entre as técnicas de detecção espectroscópica a espectrometria de massas, para a qual várias interfaces já foram desenvolvidas. O potencial analítico da cromatografia com fase líquida acoplada à espectrometria de massas é tão grande que muitas combinações de interfaces e analisadores são oferecidas comercialmente. A escolha do melhor sistema para uma determinada análise é difícil porque, seja qual for o escolhido, um balanço entre vantagens e desvantagens tem que ser feito. Embora ainda não sejam vendidos no comércio, várias aplicações interessantes do acoplamento direto de colunas capilares ou microdiâmetro tem sido experimentadas [18] e é provável que venham a substituir, futuramente, sistemas mais complicados, como aconteceu com GC/MS.

 

8.4.4 Detectores de índice de refração

Estes detectores baseiam-se nas alterações do índice de refração do eluente da coluna em relação ao da fase móvel pura. Embora sejam muito usados, eles têm várias desvantagens: pouca sensibilidade, impossibilidade de uso na eluição por gradientes e necessidade de controle severo da temperatura (± 0,001°C) para operação na sensibilidade máxima. É necessário usar, também, bombas sem pulsamentos ou bombas recíprocas equipadas com um amortecedor de pulsos. O resultado destas limitações pode até certo ponto ser controlado pelo uso de sistemas diferenciais nos quais o eluente da coluna é comparado com um fluxo de fase móvel pura usado como referência. Os dois tipos principais são os refratômetros de deflexão e os refratômetros de Fresnel.

 

Refratômetros de deflexão

Estes refratômetros medem a deflexão de um feixe de luz monocromática em um prisma duplo no

qual a célula de referência e da amostra estão separados por uma divisória diagonal de vidro (Fig.

8.10). Quando ambas as células contêm solventes de mesma composição, não ocorre deflexão do feixe. Se, porém, a composição da fase móvel que passa pela coluna muda devido à presença de um soluto, o índice de refração se altera, provocando deflexão do feixe. A magnitude da deflexão depende da concentração do soluto na fase móvel.

 

Refratômetros de Fresnel

Estes refratômetros medem alterações da relação entre a luz refletida e transmitida por uma interface vidro/líquido quando o índice de refração do líquido muda. Neste tipo de detector, a fase móvel da coluna e um fluxo de solvente, como referência, passam por pequenas células em uma das superfícies de um prisma. Quando os dois líquidos são idênticos, não há diferença entre os dois feixes que chegam à fotocélula. Quando, porém, a fase móvel contendo soluto passa pela célula, existe uma diferença na intensidade da luz que chega à fotocélula e um sinal é produzido. O pequeno volume das células deste tipo de detector (cerca de 3 μl) torna-o apropriado para colunas de alta eficiência, contudo, para manter a alta sensibilidade, as janelas da célula têm que estar escrupulosamente limpas.

Fig. 8.10 Detector de índice de refração

 

8.4.5 Detectores eletroquímicos

Embora existam detectores comerciais para monitorar algumas reações químicas — amperométricos, voltamétricos ou polarográficos, potenciométricos ou eletrodos e coulométricos

— eles não são muito usados. Os detectores polarográficos são talvez os mais comuns (Fig. 8.11). Eles podem medir correntes da ordem de nanoampères no eletrodo de trabalho de carbono vitrificado, o que corresponde a 5 pg de material reduzido. Mais de 500 compostos diferentes já foram detectados, de drogas a fenóis em água. A dificuldade é que os detectores polarográficos são muito sensíveis à velocidade do escoamento e à temperatura. Eles também exigem solventes misturados com água, livres de oxigênio. Por isso, os detectores polarográficos não são tão usados como os detectores espectroscópicos. Uma outra complicação é que é necessário manter sempre bem polida a superfície do eletrodo de carbono vitrificado para garantir um tempo de resposta suficientemente rápido para a detecção cromatográfica.