Vogel: Análise Química Quantitativa
8.5 Eficiência da coluna
Fig. 8.11 Detector eletroquímico
Em contraste com os detectores que dependem da oxidação ou da redução, os que se baseiam no equilíbrio do sistema, em particular a condutividade, são muito usados na cromatografia com íons. Devido ao modo de operação, estes detectores são simples, têm volumes internos pequenos e podem ser considerados como universais para muitos ânions e cátions. Entretanto, sua sensibilidade é determinada principalmente por processos que ocorrem antes da chegada ao detector.
8.5 Eficiência da coluna
A análise dos fatores que afetam a eficiência de separação levou ao desenvolvimento da chamada teoria dos pratos, primeiramente adaptada para a cromatografia por Martin e Synge. A teoria dos pratos levou ao tratamento, mais elaborado, da teoria da velocidade, expressa pela equação de van Deemter. As idéias que levaram a estes conceitos teóricos serão consideradas em mais detalhes no
Cap. 9. Olhe, entretanto, a Seção 6.9 e a Fig. 6.6 onde são explicados a equação que calcula o número de pratos teóricos em uma coluna, os tempos de retenção tr, a largura w e a largura a meia altura w 1/2.
Em todas as formas de cromatografia, a largura de uma banda depende de efeitos químicos que ocorrem na coluna e, também, do desenho do equipamento em uso. Volumes mortos têm sérios efeitos sobre a resolução, mais pronunciados em HPLC, onde pequenas velocidades de fluxo e soldas complicadas podem causar o alargamento dos picos, a menos que o sistema seja planejado cuidadosamente. Siga sempre, cuidadosamente, quaisquer instruções para reduzir volumes mortos. É preciso também que o mecanismo de separação, a coluna e a fase móvel sejam adequados à amostra.
O fator de capacidade de um dado soluto está diretamente ligado à natureza do soluto, à fase estacionária, à fase móvel e à temperatura. Ele mede a eficiência do processo de separação que ocorre na interface entre as fases. No caso de dois solutos, a separação dos picos exige valores diferentes de k′ para cada componente e pode-se definir um fator de separação ou de seletividade α como
Por convenção, os picos são escolhidos de modo que α > 1. Os dois termos, α e k′, entretanto, não são suficientes para definir completamente o sistema. Além das interações entre o soluto e as duas fases (eficiência do solvente), outros mecanismos sempre levam ao alargamento dos picos. O alargamento pode ser medido pela resolução Rs entre dois picos adjacentes, que em cromatografia é definida como
Com esta definição, a separação ocorre na linha de base quando R s = 1,5.
Alguns exemplos de cálculo, baseados em dados de HPLC, mostram como é importante o desenho do sistema, especialmente no caso de colunas modernas, pequenas. Vamos assumir que a largura total do pico wt é composta pela largura wc, devida à dispersão na coluna, e pela largura we, devida a outros efeitos na coluna. Como wc e we são fontes de erro na medida, são tratados como variâncias, isto é,
Exemplo 8.1
Temos, para uma coluna de 25 cm × 4,6 mm com empacotamento de 5 μm de diâmetro e considerando que 70% do volume é de solvente,
volume total 2 = 250 × (4,6)/2 × π = 4,15 ml
volume do solvente = 4,15 × 0,7 = 2,9 ml
Se o número N de pratos for 12 500, típico deste tipo de coluna, e se a eluição de um pico não resolvido usa um volume unitário de solvente
Para w t não ser maior do que 110% de wc, isto é, para um aumento de 10% na largura da coluna devido a outros efeitos,
Como os volumes de injeção normais são da ordem de 20 μl, temos
volume do detector = 5–20 μl
volume da conexão = 20 μl (assumindo 10 cm de
0,5 mm diâmetro interno s.s.)
volume total = 45–60 μl
Assim, nestes sistemas o aumento na largura do pico devido a outros efeitos de coluna é raramente superior a 10%.
Exemplo 8.2
Para uma coluna de 25 cm × 2,1 mm com empacotamento de 3 μm de diâmetro (mesma densidade de empacotamento),
volume total = 866 μl
volume do solvente = 606 μl
Para N = 30 000 (observe o aumento do número de pratos) isto corresponde a wc = 14 μl e para um aumento máximo de 10% devido a we, temos we = 6,4 μl. Para este tipo de coluna, não somente o volume da amostra deve ser pequeno (1 μl), como todas as demais causas de alargamento, como o volume do detector e as conexões, devem ser consideradas cuidadosamente, porque menos de 7 μl de volume morto leva a 10% de alargamento do pico.
Detectores com volume menor do que 5 μl já são comuns. O mesmo acontece com conexões de pequeno volume.
Diâmelro inlerno (mm) 0.5 0,25 0,12
Volume (μl) com comprimento 10 cm 19.63 4,5 1,1
Considerações do mesmo tipo aplicam-se a sistemas GC, mas, devido ao diâmetro relativamente pequeno das colunas, especialmente na cromatografia com coluna capilar, os problemas mais importantes são os volumes mortos ou não alcançados no interior do injetor ou do detector. O desenho cuidadoso destes componentes, novamente, é essencial para a melhor resolução. É preciso ter cuidado também com o desenho dos sistemas de injeção no caso de grandes volumes de amostra. Assim, por exemplo, 1 μl de um solvente típico pode se expandir no injetor até 1000 μl de gás, o que pode afetar seriamente a resolução de uma coluna quando a velocidade do fluxo é de apenas 1-2 ml·min–1.