Vogel: Análise Química Quantitativa
17.3 Fluorimetria (teoria)
Se a solução-teste não obedece à lei de Beer, é melhor preparar uma curva de
calibração usando um conjunto de padrões de concentração conhecida. Coloque as leituras do instrumento em gráfico contra as concentrações, em mg/ml ou mg/1000 ml. Para maior precisão, as curvas de calibração devem cobrir as faixas de diluição em que a comparação com o desconhecido vai ser feita. O instrumento também pode provocar desvios da lei de Beer. Assim, por exemplo, se a fotomultiplicadora não está funcionando corretamente, obtém-se uma linha reta, mas a linha irá cortar o eixo de concentrações fora do zero. Se as cubetas (células) estiverem sujas, a linha cortará o eixo de absorbâncias em um valor maior do que zero.
17.3 Fluorimetria (teoria)
A fluorescência é o resultado da absorção de energia radiante e emissão de parte desta energia na forma de luz. A luz emitida tem, quase sempre, comprimento de onda maior do que a luz absorvida (lei de Stokes). Na fluorescência, a absorção e a emissão ocorrem em um tempo curto porém mensurável, da ordem de 10–12 –9 a 10 segundos. Se ocorre um retardamento (>10”8segundos) porque a transição é proibida, o fenômeno é conhecido como fosforescência. O retardamento pode ser de frações de segundo ou de várias semanas. A fluorescência e a fosforescência são casos particulares da fotoluminescência, um termo geral aplicado aos fenômenos de absorção e reemissão de luz.
O tipo de fotoluminescência mais usado hoje em dia em química analítica é a
fluorimetria, que se distingue das demais formas de fotoluminescência pelo fato de a molécula excitada retornar ao estado fundamental imediatamente após a excitação. Quando uma molécula absorve um fóton de radiação ultravioleta, ela sofre uma transição a um estado eletrônico excitado e um de seus elétrons é promovido para um orbital de energia mais alta. Existem dois tipos importantes de transições para as moléculas orgânicas:
(a) n → π*, em que um elétron de um orbital não-ligante é promovido a um orbital π
antiligante.
(b) π → π*, em que um elétron de um orbital π ligante é promovido a um orbital π
antiligante.
A excitação do tipo π → π* provoca fluorescência significativa. A excitação do tipo n → π* produz fluorescência pouco intensa. As transições eletrônicas de bandas de transferência de carga também provocam fluorescência intensa. A energia eletrônica, entretanto, não é o único tipo de energia afetado quando uma molécula absorve um fóton de radiação ultravioleta. As moléculas orgânicas têm um grande número de vibrações e cada uma delas contribui com uma série de níveis vibracionais quase igualmente espaçados para cada estado eletrônico. Os vários estados de energia disponíveis para uma molécula podem ser representados por meio de um diagrama de níveis de energia. Procure mais detalhes na Seção 17.42.
Para que uma molécula emita radiação por fluorescência, ela deve, primeiro, ser
capaz de absorver radiação. Nem todas as moléculas que absorvem no ultravioleta ou no visível são fluorescentes e é útil quantificar a fluorescência de uma dada molécula. O rendimento quântico é definido como a fração da radiação incidente que é reemitida como fluorescência em um determinado comprimento de onda.
Algumas das moléculas excitadas podem perder o excesso de energia por dissociação de uma ligação, o que leva a uma reação fotoquímica, ou podem retornar ao estado fundamental por outros mecanismos. O rendimento quântico será, então, menor do que a unidade e pode chegar a ser extremamente pequeno. O valor de ϕ f de é uma propriedade da molécula, determinada principalmente por sua estrutura. Em geral, um valor alto de ϕf está associado com moléculas que possuem um sistema extenso de ligações duplas conjugadas em uma estrutura relativamente rígida devido à formação de anéis. Um exemplo disso é a intensa fluorescência de moléculas orgânicas como o antraceno, a fluoresceína e outras estruturas aromáticas com anéis condensados. O número de espécies inorgânicas simples que são fluorescentes é mais limitado. São exemplos os compostos de lantanídeos e actinídeos, alguns compostos organometálicos e compostos como o íon tris(bipiridil) rutênio(II), Ru , que tem
rendimento quântico igual a 0,1. No caso de metais, esta limitação pode ser superada pela formação de um complexo com um ligante orgânico apropriado. Muitos dos complexos de metais formados com o agente de complexação 8-hidróxi-quinolina são fluorescentes.
Aspectos quantitativos
A intensidade total de fluorescência, F, é dada pela equação F= Ia ϕf, onde Ia é a intensidade da luz absorvida e é o rendimento quântico de fluorescência. Como I 0 _ Ia+ I t, onde I0 é a intensidade da luz incidente e It é a intensidade da luz transmitida,
F = (I0 – It)ϕf
e como εcl I _ I e−(lei de Beer),
t 0
No caso de soluções que absorvem pouco, εcl é pequeno e a equação torna-se
de modo que para soluções muito diluídas (≤ alguns μg·g–1) a intensidade total de fluorescência, F, é proporcional à concentração da amostra e à intensidade da energia de excitação. É instrutivo comparar a sensibilidade que pode ser alcançada pelos métodos de absorção e fluorescência. A precisão total com que se pode medir a absorção em uma célula de 1 cm não é maior do que 0,001 unidade. Como, para a maior parte das moléculas, o valor de ε 6 é raramente maior do que 10, tem-se,
máx
usando a lei de Beer, que a menor concentração que se pode medir é
C –3 6 –9 > 10 /10 M = M
min
No caso da fluorescência, a sensibilidade é, em princípio, limitada apenas pela intensidade máxima da fonte de luz excitadora e, em condições ideais, –12 C = 10M.
mín
Em geral, o limite de detecção da técnica da fluorescência é da ordem de 10 3 vezes menor do que o limite de detecção da absorção no ultravioleta.
A seletividade pode ser também maior com os métodos de fluorescência porque
nem todas as espécies que absorvem fluorescem e porque o analista pode selecionar dois comprimentos de onda (excitação e emissão), contra apenas um nos métodos de absorção. Esta seletividade inerente pode, entretanto, ser inadequada e tem de ser, freqüentemente, realçada por separação química, por exemplo, por extração com
solvente (Cap. 6). É possível, também, melhorar a seletividade com técnicas que usam derivação, isto é, fazendo a medida de um componente da amostra com um espectro derivativo em lugar do espectro original de emissão de fluorescência. Assim, ombros pouco intensos do espectro original convertem-se em picos facilmente quantificados no espectro derivativo.