Vogel: Análise Química Quantitativa
7.2 A técnica da cromatografia em camada fina
instrumentação na aplicação da amostra, no desenvolvimento, na
densitometria e no registro dos resultados ampliou em muito a utilidade da
cromatografia em camada fina[1].
A diferença importante entre a cromatografia em camada fina e outras
formas de cromatografia é o lado prático e não o fenômeno físico envolvido
(adsorção, partição etc.). Assim, na cromatografia em camada fina a fase
estacionária é uma fina camada de um adsorvente (por exemplo, sílica gel,
celulose em pó ou alumina) colocada sobre um material rígido e inerte,
como uma placa de vidro ou uma folha de alumínio ou de plástico. Isto
significa que o processo de separação ocorre em uma superfície plana e
essencialmente em duas dimensões. A técnica da cromatografia em papel
foi quase completamente superada pela cromatografia em camada fina nos
laboratórios analíticos, embora seja ainda útil para fins demonstrativos
(com misturas de corantes, por exemplo). Os aperfeiçoamentos mais
recentes do desempenho, em termos de separações e medidas quantitativas,
são discutidos na Seção 7.6, que trata da cromatografia em camada fina de
alto desempenho, e na Seção 7.5, sobre TLC em duas dimensões.
A química legal tem sido muito beneficiada pelo desenvolvimento da
cromatografia em camada fina, por causa de seu uso extensivo na análise
preliminar de drogas[2,3]. Particularmente importantes são as aplicações
especializadas no estudo da composição de pontas de fibras de canetas[4],
de fitas de máquinas de escrever[5] e de impressoras de computador[6].
7.2 A técnica da cromatografia em camada fina
Preparação da placa
Vários materiais adsorventes podem ser usados em TLC porém sílica gel é
o mais comum. Uma suspensão do adsorvente (sílica gel, celulose em pó
etc.) é depositada uniformemente sobre a placa, com o auxílio de um
dispositivo comercial próprio. A espessura de adsorvente recomendada é de
150-250 μm. Após secagem ao ar por algumas horas ou em estufa a 80-
90°C por cerca de 30 minutos, a placa está pronta para o uso. Placas para uso imediato (isto é, placas de vidro ou plástico já contendo a camada
adsorvente) podem ser obtidas comercialmente. A vantagem principal do
plástico é poder ser cortado até o tamanho ou forma que se deseja, porém as
placas de plástico têm que ser apoiadas em um suporte no tanque de
cromatografia para não dobrarem. Dois pontos têm importância prática:
1. As placas de TLC devem ser manuseadas cuidadosamente pelas bordas.
Não se deve tocar a superfície da placa para evitar contaminação.
2. É aconselhável limpar a placa antes de usá-la, de modo a remover
eventuais impurezas do adsorvente. Isto pode ser feito utilizando-se o
solvente de desenvolvimento para levar uma corrida até a extremidade
superior da placa e secando, em seguida, antes do uso.
Aplicação da amostra
A linha de origem, na qual se aplica a amostra, está usualmente 2,0 a 2,5 cm
da extremidade inferior da placa. É muito importante, quando se deseja
fazer análise quantitativa, aplicar as “manchas” de amostra com acurácia e
precisão. Usam-se volumes de 1, 2 ou 5 μl, medidos em um instrumento de
precisão, isto é, uma seringa ou uma micropipeta (a micropipeta é um tubo
capilar calibrado ligado a uma pequena chupeta de borracha). Deve-se ter
cuidado para não perturbar a superfície da camada de adsorvente porque
isto distorce a forma das manchas no cromatograma desenvolvido e
atrapalha a análise quantitativa. Para ajudar a colocar a amostra na posição
correta, pode-se usar coberturas de plástico com furos estrategicamente
colocados.
Quando estiver fazendo análise quantitativa ou semiquantitativa lembre-
se de que podem ocorrer perdas de material se na aplicação da amostra for
usada uma corrente de ar para secar as manchas. O uso de misturas de
solventes de baixo ponto de ebulição facilita a secagem e ajuda a manter as
manchas compactas (menos de 2-3 mm de diâmetro). A Fig. 7.1 ilustra o
arranjo usual para comparação de amostras e padrões em TLC.
Desenvolvimento das placas O cromatograma é usualmente desenvolvido com a técnica ascendente, na
qual a placa é imersa 0,5 cm no solvente de desenvolvimento (deve-se usar
solvente redestilado ou de grau cromatográfico). Colocam-se fitas de papel
de filtro nas paredes da cuba, mergulhadas no solvente, para garantir que a
cuba fique saturada com vapor de solvente (Fig. 7.2). Permite-se o
desenvolvimento até que a frente de solvente atinja a distância necessária
(usualmente 10 a 15 cm), remove-se a placa e marca-se a posição da frente
de solvente com um objeto pontudo. Seca-se a placa em capela ou em
estufa. Na secagem, deve-se levar em consideração a sensibilidade da
amostra ao calor e à luz.
Os diversos solutos separados podem ser localizados por diferentes
métodos. Substâncias coloridas podem ser vistas diretamente sobre a fase
estacionária. Substâncias incolores podem ser detectadas borrifando-se a
placa com um reagente apropriado que colore as regiões ocupadas pelas
manchas. Os reagentes de revelação devem ser manipulados em capela.
Alguns compostos podem ser localizados com luz ultravioleta, sem
necessidade de revelação, se forem fluorescentes. Uma alternativa, se o
adsorvente da placa de TLC contiver um material fluorescente, é observar
os solutos com luz ultravioleta como manchas escuras em um fundo
fluorescente. Quando utilizar este método proteja os olhos com óculos
especiais. As manchas assim determinadas podem ser marcadas com uma
agulha.
Fig. 7.1 Placa de camada fina: os padrões são desenvolvidos ao mesmo tempo que as misturas
Fig. 7.2 Desenvolvimento da placa. (Reprodução com permissão de D. Abbott e R. S. Andrews, 1965, An introduction to chromatography, Longman, Londres.)
Medida e identificação de solutos O sucesso da cromatografia em camada fina depende dos solventes de
desenvolvimento e das afinidades diferentes dos solutos pelo adsorvente da
placa. A ordem de separação das substâncias depende das combinações de
solventes utilizadas. Sob condições constantes de temperatura, sistema de
solventes e adsorvente, qualquer soluto (uma droga, um corante, um
esteróide etc.) move-se com uma razão constante em relação à frente de
solvente. Esta razão é conhecida como valor R f (frente relativa ou fator de retardamento)[7], onde
O cálculo, mostrado na Fig. 7.3, produz resultados que são números
decimais menores do que um. Por isso, e para evitar o emprego de casas
decimais, costuma-se usar hRf, um número inteiro obtido multiplicando-se
Rf por 100. Assim, um Rf igual a 0,57 passa a ser um hRf igual a 57.
Para ajudar a comparação dos resultados e a identificação dos solutos por
TLC, bibliotecas de valores de Rf e hRf têm sido compiladas. Elas são
particularmente importantes em estudos em toxicologia[8], em que sistemas
de TLC padronizados muito detalhados são especificados.
Medidas quantitativas
Os métodos quantitativos de análise de solutos separados em um
cromatograma em camada fina podem ser divididos em duas categorias.
Nos métodos in situ, mais geralmente usados, a quantificação é baseada na
medida direta da densidade óptica das manchas na placa, de preferência
com o auxílio de um densitômetro. O densitômetro varre as manchas uma
por uma, medindo a reflexão ou a absorção de um feixe de luz. Usualmente,
faz-se a varredura ao longo da linha de desenvolvimento da placa. A
diferença de intensidade do feixe de luz refletido (ou transmitido) entre o
adsorvente e as manchas de soluto é vista como uma série de picos em um
registrador. As áreas dos picos correspondem às quantidades das
substâncias existentes nas várias manchas. Este tipo de procedimento requer a comparação das manchas da amostra com manchas obtidas com
quantidades conhecidas de padrões cromatografados na mesma placa.
Desenhos melhores de densitômetros fizeram com que aumentasse a
confiança nas determinações quantitativas de TLC.
Fig. 7.3 Como medir os valores de Rf
Um procedimento mais barato é remover os componentes separados por
raspagem da porção relevante do adsorvente após visualização com uma
técnica não destrutiva. O componente é então convenientemente extraído
colocando-se o adsorvente em um tubo de centrífuga e adicionando um
solvente adequado para dissolver o soluto. O tubo é então centrifugado e o
líquido supernadante removido e analisado por uma técnica quantitativa
apropriada, como a espectrometria no ultravioleta ou no visível, ou a
espectrometria de fluorescência ou, ainda, a cromatografia com fase gasosa.
Um outro procedimento é extrair o soluto por transferência do adsorvente
para uma coluna curta de sílica gel colocada sobre um filtro sinterizado e
eluição com o solvente utilizado no desenvolvimento. A seguir, o extrato é
analisado por uma técnica quantitativa conveniente. Em cada caso é
necessário obter uma curva de calibração usando quantidades conhecidas do
soluto no solvente usado no desenvolvimento do cromatograma.
Para que os resultados obtidos por estes métodos quantitativos de TLC
sejam de melhor qualidade, as manchas devem ter Rf = 0,3-0,7. Manchas com Rf < 0,3 tendem a estar muito concentradas e manchas com Rf > 0,7 são muito difusas.