Rang e Dale: Farmacologia
Princípios gerais dos ensaios biológicos
Preencher a lacuna entre eventos em nível molecular e em termos
fisiológico e terapêutico apresenta dificuldades, pois, com frequência, as
doenças humanas não podem ser reproduzidas com precisão em animais
experimentais. O uso de animais transgênicos para simular as doenças
humanas é discutido posteriormente com mais detalhes.
PRINCÍPIOS GERAIS DOS ENSAIOS BIOLÓGICOS
Uso de padrões
Em 1950, J.H. Burn assinalou: “Atualmente, os farmacologistas repelem o
braço do rei, mas têm de engolir o sapo, o rato e o camundongo, isso para
não falar do porquinho-da-índia e do pombo”. Burn fazia referência ao fato
de que o “braço do rei” (a braça) fora abandonado havia muito tempo como
unidade de comprimento, enquanto a atividade dos fármacos continuava a
ser definida em termos da dose necessária para causar, por exemplo, vômito
em um pombo ou parada cardíaca em um camundongo. Uma pletora de
“unidades-pombo”, “unidades-camundongo” e outras semelhantes, sobre as
quais não havia consenso entre os laboratórios, contaminou a literatura.3
Mesmo que dois laboratórios não concordassem – porque seus pombos
eram diferentes – quanto à atividade em unidades-pombo da mesma
amostra de uma substância ativa, eles podiam, contudo, concordar que a
preparação X era, digamos, 3,5 vezes mais ativa do que a preparação padrão
Y no teste do pombo. Portanto, os ensaios biológicos são projetados para
medir a potência relativa de duas preparações – em geral, um padrão e
outra desconhecida. A manutenção de preparações estáveis de diferentes
hormônios, antissoros e outros materiais biológicos, como padrões de
referência nos EUA, é função do UK National Board for Biological
Standards Control.
Figura 8.2 Medição do efeito dos fármacos glicocorticoides na expressão do
receptor de superfície celular usando FACS (separação de células ativada por fluorescência). A tecnologia FACS permite a detecção e a medição de anticorpos marcados por fluorescência ligados a estruturas de células individuais. Nesse experimento, é testado o efeito de três glicocorticoides na expressão de um receptor removedor de hemoglobina de superfície celular (CD 163). Monócitos humanos foram isolados do sangue venoso (A) e incubados por 8 h (B), sozinhos ou com diversas concentrações dos
glicocorticoides dexametasona, prednisona ou hidrocortisona (ver Capítulos 27 e 34). Em seguida, as células foram colocadas no gelo e incubadas com anticorpos marcados por fluorescência dirigidos ao receptor (C). Após, as células foram fixadas, lavadas (D) e sujeitas à análise FACS (E). De acordo com essa técnica, as células fluem por um pequeno tubo e são escaneadas por laser. A luz refletida é, então, analisada pela utilização de filtros (de modo que possam ser usadas marcas fluorescentes de diferentes cores), e os dados são recolhidos como unidades de intensidade de fluorescência, comparados com um padrão (FITC) e expressos como “equivalentes FITC” para produzir os resultados finais (F), que podem ser convertidos em uma curva log da concentração convencional. (Dados são cortesia de N. Goulding.)
Planejamento de ensaios biológicos
▼ Dado o objetivo de se comparar a atividade de duas preparações –
uma padrão (P) e uma desconhecida (D) – em uma preparação
específica, o ensaio biológico deve fornecer uma estimativa da dose ou
da concentração de D que produza o mesmo efeito biológico de uma
dose ou concentração conhecida de P. Como mostra a Figura 8.3, desde
que as curvas log dose-efeito para P e D sejam paralelas, a razão, M, das
doses equiativas não dependerá da magnitude de resposta escolhida.
Assim, M fornece uma estimativa da razão de potência entre as duas
preparações. Uma comparação da magnitude dos efeitos produzidos por
doses iguais de P e D não fornece uma estimativa de M (Figura 8.3).
O principal problema com todos os tipos de ensaios biológicos é a
variação biológica, e o planejamento do ensaio tem como objetivos:
• Minimizar a variação
• Evitar os erros sistemáticos resultantes da variação
• Estimar os limites de erro dos resultados obtidos.
Comumente, as comparações se baseiam em análises de curvas dose-
resposta, a partir das quais as doses equivalentes de P e D são
calculadas. O uso da escala logarítmica da dose significa que as curvas
para P e D normalmente serão paralelas, e a razão da potência (M) é
calculada a partir da distância horizontal entre as duas curvas (ver
Figura 8.3). Ensaios desse tipo são conhecidos como ensaios de linhas
paralelas, cujo formato mínimo é o ensaio 2 + 2, em que são usadas
duas doses da substância padrão (P1 e P2) e duas da desconhecida (D1 e
D2). As doses são escolhidas para dar respostas que caiam na parte
linear da curva log dose-resposta, sendo administradas repetidas vezes,
de forma aleatória, fornecendo uma medida inerente da variabilidade do
sistema de teste que possa ser adotada, por meio de uma análise
estatística simples, para estimar os limites de confiança do resultado
final.
A Figura 8.4 mostra um exemplo simples de experimento para comparar
dois fármacos analgésicos, morfina e codeína (ver Capítulo 43), em
humanos, com base em um esquema 2 + 2 modificado. Cada uma das
quatro doses foi administrada em ocasiões diferentes para cada um dos
quatro indivíduos, em ordem aleatória, levando-se em conta que nem o
paciente nem o observador estavam cientes da dose empregada. O alívio
subjetivo da dor foi avaliado por um observador treinado, e os
resultados demonstraram que a morfina é 13 vezes mais potente que a
codeína. É claro que isso não prova sua superioridade, mostrando
apenas que é preciso recorrer a uma dose menor para produzir o mesmo
efeito. Entretanto, tal determinação é um passo preliminar e essencial
para se avaliarem os méritos terapêuticos relativos dos dois fármacos,
pois qualquer comparação com outros fatores, como efeitos colaterais,
duração de ação, tolerância ou dependência, precisa ser feita com base
em doses analgésicas equivalentes.
Os problemas surgem se as duas curvas log dose-resposta não forem
paralelas ou se a resposta máxima for diferente, o que pode acontecer se
o mecanismo de ação dos dois fármacos for diferente, ou se um deles
for um agonista parcial (ver Capítulo 2). Nesse caso, não é possível
definir, sem ambiguidade, as potências relativas de S e U por intermédio
de uma razão simples, e o investigador precisa lidar com o fato de que a
comparação requer a medição de mais do que uma dimensão da
potência.
Figura 8.3 Ensaio biológico comparando a potência de uma substância
desconhecida e um padrão. Observe que a comparação da magnitude das respostas produzidas pela mesma dose (i. e., volume) do padrão e da desconhecida não fornece uma estimativa quantitativa de sua potência relativa. (As diferenças A e A dependem da dose 1 2 escolhida.) A comparação das doses equieficazes entre a substância padrão e a desconhecida oferece uma medida válida de suas potências relativas. Como as linhas são paralelas, a magnitude do efeito escolhido para a comparação não é importante, ou seja, o log M é o mesmo em todos os pontos das curvas.
Figura 8.4 Ensaio de morfina e codeína como analgésicos em seres humanos.
Cada um dos quatro pacientes (numerados de 1 a 4) recebeu, em ocasiões sucessivas e em ordem aleatória, quatro tratamentos diferentes (morfina em doses alta e baixa, e codeína em doses alta e baixa) por injeção intramuscular, tendo sido calculado o grau de analgesia subjetiva para cada um. As retas de regressão calculadas forneceram uma estimativa da razão de potências de 13 para os dois fármacos. (Conforme Houde, R.W. et al., 1965. In: Analgetics. Academic Press, New York.)