Mutagênese e avaliação do potencial genotóxico

crianças, ou naqueles com doença renal concomitante.

 

MUTAGÊNESE E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO

A mutagênese induzida por fármacos é importante causa de carcinogênese e

teratogênese. O registro dos medicamentos requer avaliação exaustiva de

seu potencial genotóxico. Uma vez que não existe um único teste adequado,

a abordagem habitual é a realização de uma bateria de testes in vitro e in

vivo para genotoxicidade, em geral compreendendo testes para a mutação

de genes em bactérias, testes in vivo e in vitro para a lesão dos

cromossomos e testes in vivo para a toxicidade reprodutora e

carcinogenicidade (ver adiante).

 

Tabela 58.1 Efeitos adversos de fármacos anti-

inflamatórios não esteroides no rim.

Causa Efeitos adversos

Insu ciência renal aguda isquêmica

Retenção de sódio (provocando – ou exacerbando –

Principal ação farmacológica ( hipertensão e/ou insu ciência cardíaca) i. e. , inibição da biossíntese de

prostaglandina)

Retenção de água

Hipoaldosteronismo hiporreninêmico (levando à

hiperpotassemia)

 

Não relacionada com a principal ação farmacológica (nefrite Insu ciência renal

intersticial do tipo alérgico)

Proteinúria

Não se sabe se está relacionada ou não com a principal ação Necrose papilar

farmacológica (nefropatia por analgésicos)

Insu ciência renal crônica

(Adaptada de Murray e Brater 1993.)

 

Nefrotoxicidade

 

• Células tubulares renais são expostas a elevadas concentrações de fármacos e metabólitos

quando a urina é concentrada

• A lesão renal pode causar necrose papilar e/ou tubular

• A inibição da síntese de prostaglandina por AINE provoca vasoconstrição e diminui a taxa

de ltração glomerular.

 

Mecanismos bioquímicos de mutagênese

Os agentes químicos causam mutação por meio de modificações covalentes

do DNA. Certas mutações resultam em carcinogênese, pois a sequência de

DNA afetada codifica uma proteína envolvida na regulação do crescimento.

Em geral, é necessário haver mais de uma mutação em uma célula para que

se iniciem as mudanças que resultam em malignidade, estando

particularmente relacionadas com as mutações em proto-oncogenes (que

regulam o crescimento celular) e em genes supressores de tumores (que

codificam produtos que inibem a transcrição de oncogenes) (ver Capítulos

6, 12 e 57).

▼ A maioria dos carcinógenos químicos age modificando as bases no

DNA, sobretudo a guanina, cujas posições O6 e N7 prontamente

combinam-se covalentemente com metabólitos reativos de carcinógenos

químicos. A substituição na posição O6 tem maior probabilidade de

produzir efeito mutagênico permanente, pois substituições em N7 são,

em geral, reparadas com rapidez.

A acessibilidade das bases do DNA ao ataque químico é maior quando

o DNA está em processo de replicação (i. e., durante a divisão celular).

A probabilidade de lesões genéticas por muitos agentes mutagênicos

está, portanto, relacionada com a frequência das divisões celulares. O

feto em desenvolvimento mostra-se particularmente suscetível, e os

agentes mutagênicos também são potencialmente teratogênicos por esse

motivo (p. 739). Isso é igualmente importante no que diz respeito à

mutagênese das células germinativas, especialmente em mulheres

jovens, pois, em seres humanos, a produção de oócitos primários ocorre

por meio de rápida sucessão de divisões mitóticas, logo no início da

embriogênese. Cada oócito primário, então, passa por apenas duas

divisões posteriores bem mais tardiamente, quando da ovulação. É no

início da gravidez, portanto, que as células de linhagem germinativa do

embrião feminino em desenvolvimento estão mais suscetíveis às

mutações, sendo essa mutação transmitida à prole concebida muitos

anos depois. No homem, a divisão de células germinativas ocorre

durante toda a vida, e a sensibilidade a agentes mutagênicos está

constantemente presente.

 

Mutagênese e carcinogenicidade

 

• A mutagênese envolve a modi cação do DNA

• A mutação de proto-oncogenes ou genes supressores de tumores leva à carcinogênese.

Em geral, mais de uma mutação se faz necessária

• Fármacos são causas relativamente incomuns (mas não sem importância) de defeitos

congênitos e cânceres.

Carcinogênese

A alteração do DNA é o primeiro passo na carcinogênese (ver Capítulos 6 e

57). Os compostos carcinógenos podem interagir diretamente com o DNA

(carcinógenos genotóxicos), ou agir em estágio mais avançado, aumentando

a probabilidade de a mutação resultar em tumor (carcinógenos epigenéticos;

Figura 58.2).

 

Mensuração da mutagenicidade e da carcinogenicidade

Muitos esforços foram realizados no sentido de desenvolver experimentos

que detectem a mutagenicidade e a carcinogenicidade. Testes in vitro para

mutagenicidade são utilizados para rastrear um grande número de

compostos, mas não são confiáveis como preditores de carcinogenicidade.

Testes para carcinogenicidade realizados em animais não castrados e não

modificados geneticamente são caros e consomem tempo, porém, em geral,

são exigidos pelas agências reguladoras antes de o novo fármaco ser

licenciado para uso em seres humanos. A principal limitação desse tipo de

pesquisa é que existem importantes diferenças entre as espécies, sobretudo

as relacionadas ao metabolismo de compostos estranhos e à formação de

produtos reativos.

O teste de Ames, amplamente utilizado para mutagenicidade, mede os

efeitos das substâncias na taxa de mutação reversa (i. e., reversão de

mutante à forma selvagem) em Salmonella typhimurium.

▼ A cepa selvagem pode crescer em meio sem a adição de

aminoácido, pois é capaz de sintetizar todos os aminoácidos de que

precisa. Uma forma mutante do organismo não pode produzir histidina

dessa maneira e, portanto, cresce apenas em meio que contenha esse

aminoácido. O teste de Ames envolve o crescimento do mutante em

meio contendo pequena quantidade de histidina, mais o fármaco a ser

testado. Após algumas divisões, a histidina torna-se escassa, e as únicas

células que continuam a se dividir são aquelas que retornaram à forma

primitiva. A contagem das colônias que se segue à subcultura em placas

deficientes em histidina revela a medida da taxa de mutação.

Carcinógenos primários provocam mutações por ação direta no DNA

bacteriano, mas muitos carcinógenos têm de ser convertidos em um

metabólito ativo (ver Figura 58.2). Portanto, é necessário incluir na

cultura enzimas que catalisem essa conversão. Em geral, emprega-se um

extrato de fígado de rato tratado com fenobarbital para induzir enzimas

hepáticas. Há muitas variações com base no mesmo princípio.

Figura 58.2 Sequência de eventos em mutagênese e carcinogênese. Alterações aos padrões de metilação e acetilação do DNA e histonas de uma forma epigenética podem alterar a expressão de genes durante a transcrição, tradução ou até mesmo após tradução, aumentando a probabilidade de formação de carcinoma.

 

Outros testes in vitro a curto prazo para substâncias químicas genotóxicas

incluem a mensuração da mutagênese em células de linfoma murino e a

busca de aberrações cromossômicas e trocas de cromátides-irmãs em

células ovarianas de hamsters chineses. No entanto, todos os testes in vitro

apresentam alguns resultados falso-negativos e falso-positivos.

Testes in vivo para carcinogenicidade envolvem a detecção de tumores

em grupos de animais de teste. Testes de carcinogenicidade são

inevitavelmente lentos, pois costuma haver latência de meses ou anos antes

de os tumores se desenvolverem. Além disso, tumores podem se

desenvolver de forma espontânea em animais-controle, e os resultados

quase sempre oferecem apenas evidências equivocadas a respeito da

carcinogenicidade do fármaco testado, tornando difícil para a indústria e

para as agências reguladoras decidirem o posterior desenvolvimento e o

possível licenciamento de um produto. Nenhum dos testes descritos até

agora pode, de maneira confiável, detectar carcinógenos epigenéticos. Para

fazer isso, estão sendo avaliados alguns testes que medem os efeitos das

substâncias na formação de tumores, na presença de doses limiares de um

agente genotóxico separado.

São conhecidos poucos fármacos terapêuticos utilizados na clínica que

aumentem o risco de câncer, sendo os grupos mais importantes aqueles que

atuam no DNA, isto é, fármacos citotóxicos e imunossupressores (ver

Capítulos 57 e 27, respectivamente) e hormônios sexuais (p. ex.,

estrógenos, ver Capítulo 36).

 

Teratogênese e anomalias congênitas induzidas por fármacos Teratogênese significa produção de malformações estruturais grosseiras

durante o desenvolvimento fetal, diferente de outros tipos de lesão fetal

induzidos por fármacos, como retardamento do crescimento, displasia (p.

ex., bócio associado ao iodo) ou redução assimétrica dos membros

resultante de vasoconstrição causada pela cocaína (ver Capítulo 50), em um

membro que se desenvolveria normalmente.

 

Carcinógenos

 

• Os carcinógenos podem ser:

– Genotóxicos, ou seja, causando mutações diretamente (carcinógenos primários) ou

após a conversão em metabólitos reativos (carcinógenos secundários)

– Epigenéticos, ou seja, aumentando a possibilidade de um mutágeno causar câncer,

embora não sejam, eles mesmos, mutagênicos

• Novos fármacos estão sendo testados para mutagenicidade e carcinogenicidade

• O teste de Ames para mutagenicidade mede a mutação reversa, em meio livre de

histidina, de um mutante de Salmonella typhimurium (que, ao contrário de sua forma

selvagem, não pode crescer sem histidina) na presença de:

– Substância química a ser testada

– Um preparado de enzimas microssomais hepáticas para gerar metabólitos reativos

• O crescimento da colônia indica que ocorreu mutagênese. O teste é rápido e barato, mas

ocorrem alguns falso-positivos e falso-negativos

• Teste para carcinogenicidade:

– Envolve a dosagem crônica de grupos de animais

– É caro e demorado

– Não existe teste que realmente sirva para carcinógenos epigenéticos.

Outras anomalias congênitas podem estar relacionadas com a função

neurocomportamental. Por exemplo, sabe-se, ou suspeita-se, que muitas

substâncias psicoativas (ver Capítulo 46) administrados durante a gravidez

aumentem o risco de problemas cognitivos e comportamentais nos

descendentes. Exemplos de substâncias que afetam o desenvolvimento fetal

de forma adversa são mostrados na Tabela 58.2.

A importância da utilização dos raios X e da infecção por rubéola como

causas de malformações fetais foi reconhecida no início do século XX, mas

apenas em 1960 é que os fármacos passaram a ser vistos como agentes

causadores de teratogênese: a experiência chocante com a talidomida levou

à reavaliação amplamente difundida quanto ao uso clínico de muitos outros

fármacos e à criação de entidades reguladoras de fármacos em muitos

países. A maioria dos defeitos congênitos (cerca de 70%) ocorre sem o

reconhecimento de qualquer fator causal. Acredita-se que a exposição a

fármacos ou a substâncias químicas durante a gestação seja responsável por

apenas 1% de todas as malformações fetais. Essas malformações são

comuns; portanto, os números absolutos de crianças afetadas são

substanciais.

 

Mecanismo da teratogênese

A época da lesão teratogênica em relação ao desenvolvimento fetal é crítica

na determinação do tipo e da magnitude do dano. O desenvolvimento fetal

em mamíferos passa por três fases (Tabela 58.3):

 

1. Formação do blastocisto.

2. Organogênese.

3. Histogênese e maturação da função.

A divisão celular é o principal processo que ocorre durante a formação do

blastocisto. Nessa fase, alguns fármacos podem destruir o embrião pela

inibição da divisão celular, mas, em caso de sua sobrevivência, o

desenvolvimento subsequente, em geral, não parece ser comprometido. O

etanol é uma exceção, pois afeta o desenvolvimento mesmo nesse estágio

inicial (ver Capítulo 50).

 

Tabela 58.2 Efeitos adversos no desenvolvimento fetal

humano relatados para algumas substâncias.

 

Agente Efeito(s) Ver Capítulo a congênita Risco de anomalia

Focomelia, defeitos cardíacos, atresia intestinal

Talidomida K Este capítulo

etc.

Nariz em sela; atraso de crescimento; defeitos dos

Varfarina K 25

membros, olhos, sistema nervoso central

Corticosteroides Fenda palatina e catarata congênita – raro — 34

Andrógenos Masculinização em mulheres — 36

Estrógenos Atro a testicular em homens — 36

Adenose vaginal no feto feminino, também +20 anos mais

Estilbestrol 36

câncer vaginal ou colo do útero tarde

Fenda labial/palatina, microcefalia, atraso

Fenitoína K 46

mental

Defeitos do tubo neural (p. ex., espinha bí da,

Valproato K 46

anomalias da face)

Carbamazepina Atraso do crescimento da cabeça fetal S 46

Fármacos citotóxicos Hidrocefalia, fenda palatina, defeitos do tubo K 57

(especialmente antagonistas neural etc.

do folato)

Aminoglicosídios Surdez — 52

Escurecimento de ossos e dentes, esmalte

Tetraciclina S 52

dentário no, alteração do crescimento do osso

Etanol Síndrome fetal alcoólica K 50

Nicotina Função neurológica alterada K 49

Retinoides Hidrocefalia etc. K 28

Inibidores da enzima

Oligo-hidrâmnio, insu ciência renal K 23

conversora da angiotensina

a K, sabe-se que tem risco elevado de anomalia congênita (em animais experimentais e/ou seres humanos); S, suspeita-se que

cause ou aumente o risco de anomalia congênita (em animais experimentais e/ou seres humanos).

 

Tabela 58.3 Natureza dos efeitos dos fármacos no

desenvolvimento fetal.

 

Período de gestação em Principais processos

Estágio Afetado por

seres humanos celulares

Fármacos citotóxicos, álcool

Formação do blastocisto 0 a 16 dias Divisão celular

(?)

Divisão Teratógenos

Migração Teratógenos

17 a 60 dias,

Organogênese

aproximadamente

Diferenciação Teratógenos

Morte Teratógenos

Histogênese e maturação 60 dias até o nal Igual ao anterior Fármacos diversos (p. ex.,

funcional álcool, nicotina, fármacos

antitireoidianos, esteroides)

 

Os fármacos podem causar malformações grosseiras se administrados

durante a organogênese (dias 17 a 60 em seres humanos). A organização

estrutural do embrião ocorre em uma sequência bem-definida: olhos e

cérebro, esqueleto e membros, coração e vasos maiores, palato e sistema

urogenital. O tipo de malformação produzida depende da época de

exposição ao teratógeno.

Os mecanismos celulares por meio dos quais as substâncias

teratogênicas produzem seus efeitos não são bem compreendidos. Há

sobreposição considerável entre mutagenicidade e teratogenicidade. Em

uma grande pesquisa, entre 78 compostos, 34 eram tanto teratogênicos

quanto mutagênicos, 19 eram negativos em ambos os testes e 25 (entre eles,

a talidomida) eram positivos em um, mas não no outro. A lesão ao DNA é

importante, mas não é o único fator. O controle da morfogênese é pouco

compreendido; derivados de vitamina A (retinoides) estão envolvidos e

representam teratógenos potentes (ver p. 741 e Capítulo 28). Teratógenos

conhecidos também incluem muitos fármacos (p. ex., metotrexato e

fenitoína) que não reagem diretamente com o DNA, mas que inibem sua

síntese por causa de seu efeito no metabolismo do folato (ver Capítulo 26).

A administração de folato durante a gravidez reduz a frequência tanto de

malformações espontâneas quanto as induzidas por fármacos, sobretudo

defeitos do tubo neural.

O feto depende do suprimento adequado de nutrientes durante o estágio

final da histogênese e da maturação funcional, e seu desenvolvimento é

regulado por vários hormônios. Nesse estágio, malformações estruturais

grosseiras não surgem a partir da exposição a mutágenos, mas fármacos que

interfiram no suprimento de nutrientes, ou no meio hormonal, podem apresentar efeitos deletérios no crescimento e no desenvolvimento. A

exposição de um feto feminino a andrógenos nesse estágio pode causar

masculinização. O estilbestrol (um estrógeno sintético, agora raramente

utilizado, licenciado para tratar câncer de mama ou de próstata) foi

comumente administrado às gestantes com história de aborto recorrente

durante os anos 1950 (por motivos infundados). Utilizado desse modo,

provocou displasia da vagina em crianças do sexo feminino e aumento da

incidência de carcinoma da vagina, uma doença maligna rara, praticamente

sem incidência de base, em sua prole durante a adolescência e por volta dos

20 anos de idade. A angiotensina II desempenha importante papel nos

estágios mais avançados do desenvolvimento fetal e no funcionamento

renal do feto, e inibidores da ECA e antagonistas dos receptores de

angiotensina (ver Capítulo 23) causam oligo-hidrâmnio e insuficiência renal

se administrados nessa fase da gravidez, além de malformações fetais, se

administrados mais cedo.

 

Teste para teratogenicidade

O desastre com a talidomida mostrou, de maneira dramática, a necessidade

de se realizarem testes de rotina para teratogenicidade em novos fármacos

terapêuticos. A detecção de teratogênese induzida por fármacos em seres

humanos é um problema particularmente difícil, porque a taxa de

malformações “espontâneas” é elevada (3 a 10%, dependendo da definição

do significado de malformação) e altamente variável entre diferentes

regiões, grupos etários e classes sociais. É necessário realizar estudos em

larga escala e a longo termo, sendo os resultados muitas vezes

inconclusivos.

▼ Estudos que utilizam células-tronco embrionárias para a avaliação

da toxicidade no desenvolvimento têm se mostrado promissores.

Métodos in vitro, com base na cultura de células, órgãos ou embriões

inteiros, não foram, contudo, desenvolvidos até o momento a ponto de

predizer satisfatoriamente a teratogênese in vivo, e a maioria das

agências reguladoras requer a realização de testes de teratogenicidade

em roedores e mais uma espécie de não roedores (p. ex., coelho).

Fêmeas grávidas recebem variadas doses, em diferentes níveis, no

período crítico da organogênese, e os fetos são examinados em busca de

anomalias estruturais. No entanto, correlações fracas entre espécies

cruzadas significam que testes desse tipo não são confiáveis na predição

em seres humanos e, em geral, recomenda-se que novos fármacos não

sejam utilizados na gravidez, a menos que se mostrem essenciais.

 

Alguns teratógenos definidos e prováveis em seres humanos

Embora se tenha descoberto que muitos fármacos são teratogênicos em

graus variados nas experiências realizadas com animais, relativamente

poucos são sabidamente teratogênicos em seres humanos (ver Tabela 58.2).

Alguns dos mais importantes são discutidos a seguir.

 

■ Talidomida

Em dosagens terapêuticas, a talidomida é quase única na produção de

praticamente 100% de bebês malformados quando administrada nas

primeiras 3 a 6 semanas de gestação. Foi introduzida em 1957, como

hipnótico e sedativo, com a característica especial de se mostrar muito

menos prejudicial em superdosagens que os barbitúricos, sendo, inclusive,

recomendada para uso específico durante a gravidez (com a propaganda de

“o hipnótico seguro”). Foi submetida ao teste de toxicidade aguda apenas

em ratos, que são resistentes à teratogenicidade da talidomida. A talidomida

foi comercializada em larga escala e com sucesso, e a primeira suspeita de sua teratogenicidade surgiu no início de 1961, por meio de relatos de

aumento súbito na incidência de focomelia (“membros de foca”, ausência

do desenvolvimento dos ossos longos dos braços e das pernas), que, até

aquele momento, era praticamente desconhecida. Mas, àquela altura, um

milhão de comprimidos já estavam sendo vendidos diariamente na

Alemanha Ocidental. Relatos de focomelia vieram simultaneamente de

Hamburgo e Sidney, estabelecendo-se, então, a conexão com a talidomida.3

O fármaco foi retirado do mercado no final de 1961, quando a estimativa

correspondia a 10 mil bebês nascidos com malformação (a Figura 58.3

ilustra o uso da ligação de dados na detecção de RAF tardia). A

investigação epidemiológica mostrou muito claramente a correlação entre o

tempo de exposição e o tipo de disfunção produzido (Tabela 58.4). Embora

o mecanismo não seja totalmente compreendido, acredita-se que a inibição

da formação de vasos sanguíneos (angiogênese) esteja envolvida.

 

Figura 58.3 Incidência de maiores anomalias fetais na Europa Ocidental após a

introdução e subsequente retirada da talidomida, ligada aos dados de venda dessa substância.

Tabela 58.4 Teratogênese da talidomida.

 

Dias de gestação Tipo de deformidade

Malformação das orelhas

21 a 22

Defeitos do nervo craniano

24 a 27 Focomelia dos braços

28 a 29 Focomelia dos braços e das pernas

Malformação das mãos

30 a 36

Estenose anorretal

 

■ Fármacos citotóxicos

Muitos agentes alquilantes (p. ex., clorambucila e cliclofosfamida) e

antimetabólitos (p. ex., azatioprina e mercaptopurina) causam

malformações quando utilizados no início da gravidez, porém, com mais

frequência, levam ao aborto (ver Capítulo 57). Antagonistas do folato (p.

ex., metotrexato) produzem incidência muito maior de grandes

malformações, evidentes tanto em nascidos vivos quanto em fetos

natimortos.

 

■ Retinoides

O etretinato, um retinoide (i. e., derivativo da vitamina A) com efeitos

marcantes na diferenciação da epiderme, é um teratógeno conhecido e causa

grande quantidade de anomalias importantes (notadamente deformidades

esqueléticas) nos fetos expostos. Dermatologistas utilizam retinoides para

tratar doenças de pele, incluindo as graves, como acne e psoríase, comuns

em mulheres jovens. O etretinato acumula-se na gordura subcutânea e é eliminado de modo extremamente lento, com quantidades detectáveis

persistentes por muitos meses após a descontinuação da dosagem crônica.

Por isso, as mulheres devem evitar a gravidez por pelo menos 2 anos após o

tratamento. A acitretina é um metabólito ativo do etretinato. É igualmente

teratogênica, mas o acúmulo tecidual é menor, e a eliminação pode,

portanto, ser mais rápida.

 

■ Metais pesados

Chumbo, cádmio e mercúrio causam malformações fetais em seres

humanos. A principal evidência vem da doença de Minamata, que recebeu

esse nome em virtudo do lugar no Japão onde ocorreu epidemia na

população local, após a ingestão de peixe contaminado com metilmercúrio,

que havia sido utilizado como fungicida por agricultores. Isso prejudicou o

desenvolvimento cerebral nos fetos expostos, resultando em paralisia

cerebral e retardamento mental, frequentemente com microcefalia. O

mercúrio, como outros metais pesados, inativa muitas enzimas por meio da

formação de ligações covalentes com sulfidrila e outros grupamentos, e

acredita-se que seja responsável por essas anomalias do desenvolvimento.

 

■ Fármacos antiepilépticos (ver Capítulo 46)

As malformações congênitas estão aumentadas duas a três vezes nos bebês

de mães epilépticas, especialmente naquelas tratadas com dois ou mais

fármacos antiepilépticos durante o primeiro trimestre e em associação com

concentrações plasmáticas acima dos níveis terapêuticos. Muitos fármacos

antiepilépticos têm sido implicados, incluindo fenitoína (particularmente

fenda labial/palatina), valproato (defeitos do tubo neural) e

carbamazepina (espinha bífida e hipospadia, uma malformação da uretra

masculina) (ver Capítulo 46). Os riscos relativos atribuíveis a diferentes fármacos antiepilépticos não estão bem-definidos, mas o valproato é