Rang e Dale: Farmacologia
Biossíntese do óxido nítrico e seu controle
convergência de várias linhas de pesquisa levou ao reconhecimento de que
o NO constitui uma molécula sinalizadora fundamental nos sistemas
cardiovascular e nervoso e apresenta função nas defesas do hospedeiro.
Uma função fisiológica do NO foi descoberta quando a biossíntese
desse gás demonstrou o fator de relaxamento derivado do endotélio descrito
por Furchgott e Zawadzki (1980) (Figuras 21.1 e 21.2). O NO é o ativador
endógeno da guanilato ciclase solúvel (GCs), que leva à formação de
monofosfato de guanosina cíclico (GMPc), um importante “segundo
mensageiro” (ver Capítulo 3) em muitas células, incluindo neurônios,
músculo liso, monócitos e plaquetas. O nitrogênio e o oxigênio são vizinhos
na tabela periódica, e o NO compartilha várias propriedades com o O 2, em particular uma alta afinidade pelo heme e outros grupos ferro-enxofre. Essa
propriedade é importante para a ativação da GC, que contém um grupo
heme, para a inativação do NO pela hemoglobina e para a regulação da
difusão do NO das células endoteliais (que expressam a cadeia alfa da
hemoglobina) para o músculo liso vascular.
O papel do NO em contextos específicos é descrito em outros capítulos:
no endotélio, no Capítulo 23; no sistema nervoso autônomo (ver Capítulo
13) e como transmissor químico e mediador da excitotoxicidade no sistema
nervoso central (SNC), nos Capítulos 38 a 40. Os usos terapêuticos dos
nitratos orgânicos e do nitroprussiato (doadores de NO) são descritos nos
Capítulos 22 e 23.
BIOSSÍNTESE DO ÓXIDO NÍTRICO E SEU CONTROLE
As enzimas NOS são fundamentais no controle da biossíntese do NO.
Existem três isoformas conhecidas: uma forma induzível (iNOS ou NOS2;
expressa em macrófagos e células de Kupffer, neutrófilos, fibroblastos, células musculares lisas de vasos e células endoteliais em resposta a
estímulos patológicos, tais como microrganismos invasores) e duas formas
constitutivas, que estão presentes em condições fisiológicas no endotélio
(eNOS ou NOS3)2 e em neurônios (nNOS ou NOS1).3 As enzimas
constitutivas geram pequenas quantidades de NO, enquanto a NOS2 produz
muito mais por causa de sua alta atividade e de sua abundância em estados
patológicos associados à liberação de citocinas.
▼ Todas as três isoenzimas da NOS são dímeros. Elas são estrutural e
funcionalmente complexas, exibindo semelhanças com as enzimas do
citocromo P450 (descritas no Capítulo 10), que são muito importantes
no metabolismo dos fármacos. Cada isoforma contém ferro
protoporfirina IX (heme), flavina adenina-dinucleotídio (FAD), flavina
mononucleotídio (FMN) e tetra-hidrobiopterina (H4B) em forma de
grupos prostéticos ligados. Elas também ligam a L-arginina, o fosfato de
nicotinamida adenina-dinucleotídio reduzido (NADPH) e cálcio-
calmodulina. Esses grupos prostéticos e ligantes controlam a
estruturação da enzima para formar o dímero ativo. NOS3 é acilada
dualmente por N-miristoilação e cisteína-palmitoilação; essas
modificações pós-translacionais provocam a sua associação a
membranas no complexo de Golgi e nas cavéolas, que são
microdomínios especializados ricos em colesterol na membrana
plasmática, derivados do complexo de Golgi. Nas cavéolas, a NOS3 é
mantida como um complexo inativo, associada à caveolina, a principal
proteína de membrana das cavéolas. A dissociação da caveolina ativa a
enzima.
O átomo de nitrogênio no NO é derivado do grupo guanidino terminal
da L-arginina. As enzimas NOS combinam as atividades de oxigenase e
de redutase. O domínio oxigenase contém heme, enquanto o domínio
redutase liga-se a cálcio-calmodulina. Em situações patológicas, a
enzima pode sofrer mudança estrutural que provoca a transferência de
elétrons entre os substratos, levando a um “desacoplamento” entre
cofatores enzimáticos e produtos, e fazendo com que elétrons sejam
transferidos para o oxigênio molecular, o que ocasiona síntese de ânion
superóxido (O − 2) em vez de NO. Este fato é importante, porque o ânion
superóxido é uma espécie reativa do oxigênio e reage com o NO para
formar um produto tóxico (ânion peroxinitrito, ver p. 263). As espécies
reativas de nitrogênio, como o peroxinitrito, atuam em conjunto com
espécies reativas de oxigênio (ERO) para danificar as células, causando
estresse nitrosativo.
Figura 21.1 Fator de relaxamento derivado do endotélio. A acetilcolina (ACh) relaxa um fragmento da aorta de coelho pré-contraída com norepinefrina (NE) desde que o endotélio esteja intacto (“sem raspagem”: painel superior), mas não se tiver sido removido por raspagem suave (“após raspagem”: painel inferior). Os números são logaritmos das concentrações molares dos fármacos. L, lavagem da preparação. (De Furchgott e Zawadzki, 1980.)
A atividade das isoformas constitutivas da NOS é controlada pela cálcio-
calmodulina intracelular (Figura 21.3). Em geral, a L-arginina, o substrato
da NOS, está em excesso no citoplasma da célula endotelial, de modo que a
taxa de produção de NO é determinada mais pela atividade da enzima do
que pela disponibilidade do substrato. Não obstante, doses muito altas de L-arginina podem restaurar a biossíntese do NO endotelial em algumas
situações patológicas (p. ex., hipercolesterolemia), nas quais a função
endotelial está comprometida. As possíveis explicações para esse paradoxo
incluem:
• Compartimentalização: por exemplo, existência de um reservatório
distinto de substrato em um compartimento celular acessível à NOS,
que pode sofrer depleção apesar das concentrações citoplasmáticas
totais de arginina aparentemente abundantes
• Competição por altas concentrações de L-arginina com inibidores
competitivos endógenos da NOS, tais como a dimetil-arginina
assimétrica (ADMA; do inglês, asymmetric dimethylarginine; ver p.
265 e Figura 21.4), que está elevada no plasma de pacientes com
hipercolesterolemia
• Reconexão da transferência de elétrons para L-arginina.
O controle da atividade NOS constitutiva por cálcio-calmodulina é exercido
de duas formas:
1. Muitos agonistas endotélio-dependentes (p. ex., acetilcolina,
bradicinina, substância P) aumentam a concentração citoplasmática de
íons cálcio, [Ca2+]i; o consequente aumento na cálcio-calmodulina ativa
NOS1 e NOS3.
2. A fosforilação de resíduos específicos na NOS3 controla sua
sensibilidade a cálcio-calmodulina; isso pode alterar a síntese de NO na
ausência de qualquer alteração na [Ca2+] . i
Figura 21.2 O fator de relaxamento derivado do endotélio (EDRF; do inglês,
endothelium-derived relaxing factor) está intimamente relacionado ao óxido nítrico (NO). A. O EDRF liberado pelas células endoteliais (CE) aórticas por ação da acetilcolina (ACh) (painel direito) tem o mesmo efeito que o autêntico NO (painel esquerdo) sobre o espectro de absorção da desoxi-hemoglobina (Hb). B. O EDRF é liberado de uma coluna de CE em cultura pela bradicinina (BK, 3 a 100 nmol) aplicada através da coluna de células (TC) e relaxa uma tira de bioensaio pré-contraída e sem endotélio, como o faz o NO autêntico (traçado superior). C. Um ensaio químico do NO com base em quimioluminescência mostra a presença de concentrações similares de NO no EDRF liberado pela coluna de células, como em soluções equipotentes de NO autêntico. (De Ignarro, L.J., Byrns, R.E., Buga, G.M. et al., 1987. Circ. Res. 61, 866-879; e Palmer, R.M.J., Ferrige, A.G., Moncada, S. et al., 1987. Nature 327, 524-526.)
Figura 21.3 Regulação da óxido nítrico sintase (NOS) constitutiva pela cálcio-
calmodulina. 2+ A. Dependência de Ca para a síntese de óxido nítrico (NO) e de citrulina a partir da L-arginina pelo citosol sinaptossômico de cérebro de rato. As velocidades de síntese de NO a partir da L-arginina foram determinadas por estimulação da guanilil ciclase (GC) ( 3 3 painel superior ) ou pela síntese de [ H]-citrulina a partir de L-[H]-arginina (painel inferior). B. Regulação da GC no músculo liso pelo NO formado no endotélio adjacente. Akt é uma proteinoquinase que fosforila a NOS, tornando-a mais sensível à cálcio-calmodulina. (Painel [A] de Knowles, R.G. et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 5159–5162.)
O estresse de cisalhamento é um importante estímulo fisiológico para a
síntese endotelial de NO nos vasos de resistência. Esse estímulo é
reconhecido por mecanorreceptores endoteliais e transduzido através de
uma serino-treonina proteinoquinase denominada Akt (ver Capítulo 3), que
também é conhecida como proteinoquinase B. Agonistas que aumentam o
cAMP nas células endoteliais (p. ex., agonistas do receptor β2-adrenérgico) aumentam a atividade da NOS3, por meio de fosforilação mediada pela