Rang e Dale: Farmacologia
Entrega de genes
• Farmacodinâmica: a expressão controlada do gene em questão
• Segurança
• Eficácia clínica e praticabilidade a longo prazo.
Existe um consenso geral de que a barreira de Weismann8 não deve ser
violada e, por conseguinte, foi acordada uma moratória sobre a realização
de alterações ao DNA das células germinativas (que poderiam influenciar
gerações futuras), e a terapia genética concentrou-se apenas em células
somáticas.
Aqui concentramo-nos primeiro nos principais problemas e abordagens
usadas para transformar a terapia de genes em medicamentos úteis, e
concluímos com uma seção final sobre o sucesso limitado alcançado até
agora.
ENTREGA DE GENES
A transferência de grandes seções de ácidos nucleicos recombinantes para
células-alvo é crítica para o sucesso da terapia genética. Nas palavras de um
comentarista (Galun, citado em Bender, 2016), “a terapia genética
compreende atualmente três pontos: entrega, entrega e entrega”. Para
ultrapassar este primeiro e mais fundamental obstáculo, técnicas
emprestadas de vírus, que são mestres no tipo de sequestro molecular
necessário para introduzir genes funcionais em células de mamíferos, são
frequentemente usadas na investigação de terapia genética. As estruturas
devem passar do espaço extracelular através do plasma e das membranas
nucleares e ser incorporadas nos cromossomos. Uma vez que o DNA é
negativamente carregado e os genes únicos têm pesos moleculares cerca de
104 vezes superiores aos dos fármacos convencionais, o problema é de uma ordem diferente do estágio equivalente do desenvolvimento de fármacos de
rotina.
Existem várias considerações importantes na escolha de um sistema de
entrega de genes; estas incluem:
• A capacidade do sistema (p. ex., quanto DNA consegue transportar)
• A eficiência da transfecção (a sua capacidade de entrar e ser utilizada
pelas células)
• O tempo de vida do material transfectado (determinado pelo tempo de
vida das células-alvo)
• A questão da segurança, especialmente importante no caso de sistemas
de entrega virais.
Várias abordagens foram desenvolvidas (Tabela 5.4) na tentativa de
produzir o sistema ótimo.
Existem duas principais estratégias de terapia gênica. Usando a técnica
in vivo, o vetor que contém o gene terapêutico é injetado no paciente, tanto
IV (caso em que alguma forma do órgão ou tecido-alvo é necessária) quanto
diretamente no tecido-alvo (p. ex., a retina). Quando se usa a estratégia ex
vivo, as células são removidas do paciente (p. ex., células estaminais da
medula óssea ou sangue circulante, ou mioblastos de uma biopsia de
músculo estriado) e tratadas com o vetor no laboratório. As células
geneticamente alteradas são injetadas de volta no paciente de onde vieram,
evitando, assim, qualquer rejeição imune (autóloga e não alogênica).
Um vetor ideal deve ser seguro, altamente eficiente (i. e., inserir o gene
terapêutico em uma proporção elevada de células-alvo sob controle do
promotor adequado) e seletivo, no sentido de que deve levar à expressão da
proteína terapêutica nas células-alvo, mas não à expressão de outras
proteínas virais. De modo ideal, e desde que a célula na qual é inserido tenha ela própria uma vida longa, o vetor deverá causar expressão
persistente, evitando a necessidade de tratamento repetido. A última
consideração pode ser um problema em alguns tecidos. Na doença
autossômica recessiva fibrose cística, por exemplo, o epitélio da via
respiratória funciona mal porque lhe falta um transportador de Cl– de
membrana, conhecido como regulador de transporte da fibrose cística
(CFTR; do inglês, cystic fibrosis transport regulator). As células epiteliais
nas vias respiratórias estão continuamente morrendo e sendo repostas.
Portanto, mesmo que o gene CFTR não mutado pudesse ser transfectado
para o epitélio, existiria, ainda assim, uma necessidade periódica para mais
tratamento, a menos que o gene pudesse ser inserido nas células
progenitoras (estaminais). Problemas semelhantes são antecipados em
outras células que se renovam continuamente, como o epitélio
gastrintestinal e a pele.
Vetores virais
Muitas estratégias contemporâneas de entrega de genes têm como objetivo
capitalizar a capacidade dos vírus em subverter a maquinaria transcricional
das células que infectam e a sua capacidade (em alguns casos) de se fundir
com o genoma do hospedeiro. Embora aparentemente simples, continuam
existindo problemas práticos com esta abordagem de vetor viral. Tal como
os vírus evoluíram nas formas de invadir células humanas, também as
respostas imunes dos humanos e outras contramedidas de proteção
evoluíram. Embora limitador em alguns aspectos, isso não é totalmente uma
má notícia do ponto de vista da segurança. Dado que muitos dos vírus
usados como vetores são patogênicos, eles são em geral modificados de
modo que sejam “incapazes de replicação”, para evitar toxicidade.
■ Retrovírus
▼ Se introduzidos nas células estaminais, os vetores retrovirais têm
efeitos de longa duração, porque eles são incorporados no DNA do
hospedeiro e replicam-se ao mesmo tempo que este, e, portanto, o gene
“terapêutico” é passado para cada uma das células-filhas durante a
divisão celular. Contra esse fato, a integrase retroviral insere a estrutura
nos cromossomos de forma aleatória, o que pode causar dano. Além
disso, os retrovírus poderiam infectar células germinativas diferentes
das células-alvo e produzir efeitos indesejados se administrados in vivo.
Por este motivo, os retrovírus têm sido usados principalmente para
terapia de genes ex vivo. O ciclo de vida dos retrovírus naturais pode ser
explorado para criar vetores úteis para a terapia genética (Figura 5.3).
Muitos vírus estão equipados para infectar tipos celulares específicos,
embora não necessariamente a célula-alvo de interesse. É possível
alterar o invólucro retroviral para alterar a especificidade, de modo que
o vetor seria administrado de forma sistêmica, mas afetaria apenas a
população celular desejada. Um exemplo desta abordagem com um
lentivírus (um tipo de retrovírus) é a substituição do invólucro proteico
de um vetor não patogênico (p. ex., vírus da leucemia do rato) pelo
invólucro proteico do vírus da estomatite vesicular humana, para atingir
especificamente células epiteliais humanas.
A maioria dos vetores retrovirais é incapaz de penetrar no invólucro
nuclear, e uma vez que este se dissolve durante a divisão celular, eles
afetam apenas as células em divisão em vez das células que não se
dividem (tais como os neurônios adultos).
■ Adenovírus
▼ Os vetores de adenovírus são populares em virtude da elevada
expressão transgênica que pode ser conseguida. Eles transferem genes
para o núcleo da célula hospedeira, mas (ao contrário dos retrovírus)
estes não são inseridos no genoma do hospedeiro e, portanto, não
produzem efeitos que duram pela vida da célula transfectada. Essa
propriedade também torna óbvio o risco de alterar a função de outros
genes celulares e os riscos teóricos de carcinogenicidade e transfecção
de células germinativas. Por conta dessas propriedades favoráveis, os
vetores de adenovírus têm sido usados na terapia genética in vivo. As
deleções fabricadas no genoma viral o tornam incapaz de replicar ou
causar infecção generalizada no hospedeiro enquanto, ao mesmo tempo,
criam espaço no genoma viral para que o transgene terapêutico seja
inserido.
Um dos primeiros vetores adenovirais não tinha parte de uma região de
controle de crescimento chamada E1, ao incorporar o transgene
desejado. Este vetor originava resultados excelentes, demonstrando a
transferência de genes para linhas celulares e modelos animais da
doença, mas provou desapontar como tratamento para a fibrose cística
nos ensaios humanos. Baixas doses (administradas por aerossol em
pacientes com esta doença) produziram apenas uma transferência de
eficiência muito baixa, enquanto doses mais elevadas causaram
inflamação, uma resposta imune do hospedeiro e expressão gênica de
curta duração. Além disso, o tratamento não podia ser repetido devido
ao aparecimento, na circulação, de anticorpos neutralizadores. Isso
levou a tentativas de manipular os vetores adenovirais para mutar ou
remover os genes que são mais fortemente imunogênicos.
Figura 5.3 Estratégia de marcação de vetores retrovirais. O transgene (o exemplo mostra o gene do fator IX) em um vetor esqueleto é introduzido (a) em uma célula de empacotamento, em que é integrado a um cromossomo no núcleo, e (b) transcrito para criar o vetor mRNA, que é empacotado para o interior do vetor retroviral e liberado da célula de empacotamento. Depois, ele infecta a célula-alvo (c). A transcriptase reversa codificada pelo vírus (d) converte o vetor RNA em um híbrido RNA-DNA, e depois em um DNA de cadeia dupla, que é integrado (e) no genoma da célula-alvo. Pode, depois, ser transcrito e traduzido para criar (neste caso) a proteína fator IX. “Env”, Gag’ e “Pol” representam componentes do vetor retroviral. LTR, repetição terminal longa. (Redesenhada a partir de Verma e Somia, 1997.)
■ Outros vetores virais
▼ Outros potenciais vetores virais sob investigação incluem vírus
adenoassociado, herpes-vírus e versões desativadas do vírus da
imunodeficiência humana (HIV). O vírus adenoassociado associa-se
com o DNA hospedeiro, mas não é ativado, a menos que a célula esteja
infectada com um adenovírus. É menos imunogênico do que outros
vetores, mas é difícil de ser produzido em massa e não pode ser usado
para transportar transgenes grandes. O herpes-vírus não se associa com
o DNA do hospedeiro, mas é muito duradouro no tecido nervoso (pelo
que poderia ter uma aplicação específica no tratamento de doenças
neurológicas). O HIV, ao contrário da maior parte dos outros retrovírus,
pode infectar células que não estão em divisão, como os neurônios. É
possível remover genes do HIV que controlam a replicação e substituir
outros genes. Em alternativa, pode ser possível transferir para outros
retrovírus não patogênicos os genes que permitem ao HIV penetrar no
invólucro nuclear.
Vetores não virais
Para reduzir os problemas associados com os vetores virais, uma variedade
de outras substâncias tem sido usada para entregar genes e outros materiais.
Estes são, com frequência, conhecidos em conjunto como
nanotransportadores. A lista inclui os seguintes (mas ver também Xu et al.,
2014):
■ Lipossomas
▼ Vetores não virais incluem uma variante de lipossomas (ver Capítulo
9). Plasmídios (diâmetro de até aproximadamente 2 m) são grandes
demais para caber em lipossomas normais (diâmetro 0,025 a 0,1 m),
mas partículas maiores podem ser criadas a partir de lipídios carregados
positivamente (“lipoplexos”), que interagem com as membranas
celulares negativamente carregadas e o DNA, melhorando a entrega
para o interior do núcleo celular e a incorporação no cromossomo do
hospedeiro. Essas partículas têm sido usadas para entregar genes para o
HLA-B7, a interleucina-2 e o CFTR. Eles são muito menos eficientes