Tipo 2 | Receptores acoplados à proteína G

Canais iônicos regulados por ligantes

 

• São chamados às vezes de receptores ionotrópicos

• Estão envolvidos principalmente na transmissão sináptica rápida

• Existem várias famílias estruturais, sendo a mais comum a organização heteromérica de

quatro ou cinco subunidades, com hélices transmembrana dispostas em torno de um canal

central aquoso

• A ligação do ligante e a abertura do canal ocorrem em uma escala de tempo de

milissegundos

• Os exemplos incluem os receptores nicotínicos da acetilcolina, do GABA tipo A (GABAA),

receptores de glutamato (p. ex., receptor do N-metil-D-aspartato [NMDA]) e de ATP (P2X).

 

TIPO 2 | RECEPTORES ACOPLADOS À PROTEÍNA G

Os GPCR constituem a classe única mais comum de alvos para farmácos

terapêuticos. A família GPCR engloba muitos dos receptores que são

familiares aos farmacologistas, como AChR muscarínicos, adrenorreceptores,

receptores de dopamina, receptores 5-HT (serotonina), receptores para muitos

peptídios, receptores de purinas e muitos outros, incluindo os

quimiorreceptores envolvidos no olfato e na detecção de feromônios, e

também muitos receptores “órfãos” (Fredriksson e Schiöth, 2005). Para a

maioria deles, os estudos farmacológicos e moleculares revelaram a

existência de vários subtipos. Todos apresentam uma estrutura hepta-

helicoidal (Figura 3.3B).

Muitos neurotransmissores, exceto os peptídios, podem interagir tanto

com os GPCR quanto com os canais ativados por ligantes, permitindo que a

mesma molécula produza (através dos canais iônicos ativados por ligantes)

efeitos rápidos, mas também lentos (através dos GPCR). No entanto, os hormônios peptídicos individuais geralmente agem sobre os GPCR ou sobre

os receptores ligados a quinases (ver adiante), porém raramente sobre ambos,

e uma escolha semelhante se aplica a vários ligantes que atuam sobre os

receptores nucleares.8

 

Figura 3.6 Aberturas de canais registradas através da técnica patch clamp. A. Canais iônicos ativados por acetilcolina na placa motora terminal da rã. A pipeta é pressionada contra a superfície da membrana com 10 mol/l ACh. Os desvios abaixo apresentam o fluxo da corrente através dos canais iônicos na zona da membrana em que foi aplicada a pipeta. No final do registro, é possível ver a abertura discreta entre os dois canais. B. Correntes em um único canal receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) registradas nos neurônios cerebrais na conformação exterior da parte da membrana da célula (patch). O NMDA foi adicionado ao exterior da parte da membrana da célula (patch) para ativar o canal. O canal abre-se em vários níveis de condutância. Em B, as aberturas no nível mais alto de condutância e os encerramentos subsequentes são lentos, indicando que um canal está aberto (não é provável que dois canais abram e fechem ao mesmo tempo), enquanto em (A) existem níveis discretos que indicam dois canais. (Painel [A] cortesia de D. Colquhoun e D.C. Ogden; painel [B] reproduzido, com autorização, de Cull-Candy SG e Usowicz MM, 1987. Nature 325, 525-528.)

 

Estrutura molecular

Em 1986, o primeiro GPCR farmacologicamente relevante, o β2 adrenérgico

(ver Capítulo 15), foi clonado. Mais tarde, a biologia molecular alcançou

rapidamente a farmacologia, e com o sequenciamento do genoma humano, a

sequência de aminoácidos de todos os GPCR até então identificados pelas

suas propriedades farmacológicas foi revelada, assim como a estrutura de

muitos novos GPCR. Mais recentemente, as dificuldades de cristalização dos

GPCR foram superadas, permitindo o uso da poderosa técnica de

cristalografia de raios X para estudar a estrutura molecular tridimensional

desses receptores em detalhe (Figura 3.7) (Zhang et al., 2015). Além disso, os

métodos de docking molecular computacional e ressonância magnética (RM)

foram desenvolvidos para estudar a ligação do ligante e subsequentes

alterações conformacionais associadas à ativação (Sounier et al., 2015). Esse

fato tem levado ao conhecimento de informações importantes sobre as

conformações da ligação dos antagonistas e agonistas aos receptores, bem

como sobre as interações dos receptores acoplados à proteína G. A partir

desses estudos, é possível aferir, com maior clareza, o mecanismo de ativação

dos GPCR e os fatores determinantes na eficácia dos agonistas, bem como

obter melhores bases para a concepção de novos ligantes GPCR.

Figura 3.7 Estrutura do receptor muscarínico M . Imagem de alta resolução que 2 apresenta a conformação do receptor muscarínico M ligado a um agonista (ortostérico) e 2 também a um modulador alostérico positivo. Os cilindros em amarelo representam os domínios transmembranares. A extensão total dos domínios N- e C-terminal e o terceiro circuito intracelular não estão representados. (Cortesia de A. Christopoulos.)

 

 

Os GPCR consistem em uma única cadeia de polipeptídios, normalmente

de 350 a 400 resíduos de aminoácidos, mas, em alguns casos, atingindo 1.100

resíduos. A anatomia geral é apresentada na Figura 3.3B. Sua estrutura

engloba sete α-hélices transmembranares, semelhantes às dos canais iônicos

anteriormente discutidos, com um domínio N-terminal extracelular de

comprimento variável e um domínio C-terminal intracelular.

Os GPCR são divididos em três classes principais – A, B e C (Tabela 3.2).

Existe certa homologia de suas sequências dentro do mesmo grupo, mas

pouca entre as diferentes classes. Partilham a mesma estrutura de sete

segmentos transmembranares em hélice (hepta-helicoidal), mas diferem em

outros aspectos, principalmente no comprimento do N-terminal extracelular e

na localização do domínio de ligação do agonista. A classe A é, de longe, a maior, compreendendo a maioria dos receptores para monoaminas,

neuropeptídios e quimiocinas. A classe B inclui receptores para alguns outros

peptídios, como calcitonina e glucagon. A classe C é a menor; seus principais

membros são os receptores metabotrópicos para glutamato e GABA e os

receptores sensíveis ao Ca2+.9

 

Tabela 3.2 Principais classes de receptores acoplados à

proteína G.a,b

 

Classe b Receptores Características estruturais

O maior grupo. Receptores para a maioria Cauda extracelular (N-terminal) curta. O

dos neurotransmissores aminados, muitos ligante une-se a hélices transmembrana

A: família da rodopsina

neuropeptídios, purinas, prostanoides, (aminas) ou a alças extracelulares canabinoides etc. (peptídios)

Cauda extracelular intermediária

B: família dos receptores de Receptores para hormônios peptídicos,

incorporando o domínio de ligação ao

secretina/glucagon incluindo secretina, glucagon, calcitonina

ligante

Grupo pequeno. Receptores metabotrópicos

de glutamato/sensor de cálcio de glutamato, receptores GABA , receptores B domínio de ligação ao ligante C: família do receptor metabotrópico Cauda extracelular longa incorporando o

sensíveis ao Ca2+

aOutras classes incluem receptores acoplados à proteína G (GPCR) frisada, GPCR de adesão e receptores para feromônios.

bPara listas completas, consulte <www.guidetopharmacology.org>.

 

▼ A compreensão da função desse tipo de receptor se deve muito ao

estudo de uma proteína estreitamente relacionada, a rodopsina, que é

responsável pela transdução nos bastonetes retinianos. Essa proteína é

abundante na retina, e seu estudo é muito mais fácil do que o das

proteínas receptoras (que não são abundantes); é construída em um plano

idêntico ao mostrado na Figura 3.3B e também produz resposta no

bastonete (hiperpolarização, associada à inibição da condutância ao Na+)

através de um mecanismo envolvendo uma proteína G (p. 32; ver Figura

3.9). A diferença mais óbvia é que a resposta é produzida por um fóton, e

não por uma molécula de agonista. Com efeito, a rodopsina pode ser

considerada uma proteína que incorpora sua própria molécula de agonista,

chamada retinal, a qual sofre isomerização da forma trans (inativa) para a

forma cis (ativa) quando absorve um fóton.

 

Nas moléculas menores, tais como norepinefrina e acetilcolina, o domínio da

ligação ao ligante nos receptores de classe A está inserido na fenda entre os

segmentos α-helicoidais dentro da membrana (ver Figuras 3.3B e 3.7), similar

ao espaço ocupado pelo retinal na molécula de rodopsina.10 Os ligantes

peptídicos, como a substância P (ver Capítulo 19), ligam-se mais

superficialmente às alças extracelulares, como mostrado na Figura 3.3B. A

partir de estruturas cristalinas e experimentos de mutagênese em local único,

é possível mapear o domínio de ligação ao ligante desses receptores. Avanços

recentes no docking (acoplamento molecular computacional de ligantes no

sítio de ligação do receptor) tornaram possível projetar novos ligantes

sintéticos com base primariamente no conhecimento da estrutura do receptor

(Manglik et al., 2016) – um marco importante no desenvolvimento de

medicamentos, que tem se fundamentado até agora principalmente na

estrutura dos mediadores endógenos (como a histamina) ou alcaloides

vegetais (como a morfina) para sua inspiração química.11

 

Receptores ativados por proteinase12

▼ Embora a ativação dos GPCR seja normalmente a consequência da

ligação de um agonista difuso, também pode ser resultante da ativação

por uma proteinase. Já foram identificados quatro tipos de receptores

ativados por proteinase (PAR; do inglês, protease-activated receptors;

revisados por Ramachandran et al., 2012). Muitas proteinases, como a

trombina (uma proteinase envolvida na cascata da coagulação sanguínea;

ver Capítulo 25), ativam os PAR ao removerem a extremidade da cauda

N-terminal extracelular do receptor (Figura 3.8) para expor cinco ou seis

resíduos N-terminais que se ligam aos domínios do receptor nas alças

extracelulares, funcionando como um “agonista aprisionado”. Receptores

desse tipo ocorrem em vários tecidos e parecem desempenhar um papel

na inflamação e em outras respostas a lesões de tecido, nas quais são

liberadas proteinases teciduais. Uma molécula PAR pode ser ativada

somente uma vez, porque não há como a clivagem ser revertida e, assim,

é preciso ocorrer ressíntese contínua da proteína receptora. A inativação

ocorre por meio de uma clivagem proteolítica que ata o ligante, ou por

dessensibilização, envolvendo fosforilação (Figura 3.8), quando o

receptor, então, é internalizado e degradado, sendo substituído por uma

proteína recém-sintetizada.

Receptores acoplados à proteína G

 

• São denominados algumas vezes receptores metabotrópicos ou receptores com sete

domínios transmembrana (7-TDM)

• As estruturas compreendem sete α-hélices que atravessam a membrana

• A proteína G é uma proteína de membrana que compreende três subunidades (α, β, γ), com

a subunidade a apresentando atividade GTPásica

• A proteína G interage com uma bolsa de ligação na superfície intracelular do receptor

• Quando a proteína G se liga a um receptor ocupado por um agonista, α subunidade a se liga

a GTP, dissocia-se e, então, ca livre para ativar um efetor (p. ex., uma enzima de

membrana). Em alguns casos, a subunidade βγ é a espécie ativadora

• A ativação do efetor termina quando ocorre a hidrólise da molécula de GTP ligada, o que

permite que a subunidade a se recombine com βγ

• Existem vários tipos de proteína G, que interagem com diferentes receptores e controlam

diferentes efetores

• Exemplos incluem o receptor muscarínico da acetilcolina, adrenorreceptores, receptores de

neuropeptídios e de quimiocinas, e os receptores ativados por proteinase.

Figura 3.8 Ativação de um receptor ativado por proteinase por clivagem do domínio

extracelular N-terminal. A inativação ocorre por fosforilação. A recuperação requer nova síntese do receptor.

 

Figura 3.9 Função da proteína G. A proteína G consiste em três subunidades (α, β, γ) que ficam ancoradas à membrana através de resíduos de lipídios fixos. O acoplamento da subunidade α a um receptor ocupado por um agonista promove a troca do GDP ligado pelo GTP intracelular; o complexo α-GTP, então, se dissocia do receptor e do complexo βγ, interagindo com uma proteína-alvo (alvo 1, que pode ser uma enzima, como adenilato ciclase ou fosfolipase C). O complexo βγ também ativa uma proteína-alvo (alvo 2, que pode ser um canal iônico ou uma quinase). A atividade GTPase da subunidade α aumenta quando a proteína-alvo é ligada, resultando em hidrólise do GTP ligado para GDP, o que faz com que a subunidade α volte a se ligar com βγ.

 

Proteínas G e sua função

As proteínas G englobam uma família de proteínas residentes na membrana,

cuja função é responder à ativação GPCR e transmitir a mensagem dentro da

célula aos sistemas efetores que geram uma resposta celular. Representam o

nível de coordenação intermediária na hierarquia organizacional, intervindo

entre os receptores – como diligentes oficiais atentos ao mínimo sinal de seu

agente químico preferencial – e as enzimas efetoras ou canais iônicos – a brigada de soldados rasos que executam o trabalho sem precisar saber qual

hormônio autorizou o processo. São as proteínas “de meio-campo”, que, na

realidade, foram denominadas proteínas G, devido à sua interação com os

nucleotídios guanina, GTP e GDP. Para informações mais detalhadas sobre a

estrutura e as funções das proteínas G, ver as revisões de Milligan e Kostenis

(2006) e Oldham e Hamm (2008). As proteínas G se classificam em três

subunidades: α, β e γ (Figura 3.9). Os nucleotídios guanina ligam-se à

subunidade α, que tem atividade enzimática (GTPase), catalisando a

conversão do GTP a GDP. As subunidades β e γ permanecem unidas na

forma de um complexo βγ. A subunidade “γ” está ligada à membrana através

de uma cadeia de ácidos graxos acoplada à proteína G por meio de uma

reação conhecida como prenilação. No estado de “repouso” (Figura 3.9), a

proteína G permanece como um trímero αβγ que pode, ou não, ser

previamente acoplado ao receptor, com o GDP a ocupar o local na

subunidade α. Quando um GPCR é ativado por um agonista, isso induz

pequenas alterações nos resíduos ao redor do sítio de ligação que se traduzem

em rearranjos maiores das regiões intracelulares do receptor, que abrem uma

cavidade no lado intracelular do receptor ao qual a proteína G pode se ligar,

resultando em uma interação de alta afinidade das subunidades αβγ e do

receptor. Essa interação ocorre dentro de 50 ms, causando a dissociação do

GDP ligado e sua substituição por GTP (permuta GDP-GTP), o que, por sua

vez, leva à dissociação do trímero da proteína G, liberando α-GTP das

subunidades βγ; estas são as formas “ativas” da proteína G, que se difundem

na membrana e podem associar-se a diversas enzimas e canais iônicos,

causando a ativação do alvo (Figura 3.9). Originalmente, acreditava-se que

apenas a subunidade α tinha função sinalizadora, e o complexo βγ serviria

apenas como um “acompanhante” (chaperone) que manteria as subunidades α

soltas e fora do alcance das várias proteínas efetuadoras, que, de outro modo,

seriam por elas excitadas. No entanto, os complexos βγ têm suas próprias atribuições e controlam os efetores de modo muito semelhante ao das

subunidades α. A associação das subunidades α ou βγ com as enzimas-alvo

ou os canais pode causar ativação ou inibição, dependendo de qual proteína G

esteja envolvida (Tabela 3.3). A ativação da proteína G resulta em

amplificação porque um único complexo agonista-receptor pode ativar, por

sua vez, várias proteínas G, e cada uma delas pode permanecer associada à

sua enzima efetora por tempo suficiente para produzir muitas moléculas do

composto. O composto (ver adiante) é frequentemente um “mensageiro

secundário” e ocorre uma amplificação posterior antes de ser produzida a

resposta celular final. A sinalização é concluída quando ocorre a hidrólise de

GTP para GDP pela atividade de GTPase inerente à subunidade α. O α-GDP

resultante, então, se dissocia do efetor e se religa com βγ, completando o

ciclo.

 

▼ O que a ligação da subunidade α a uma molécula efetora faz é

aumentar sua atividade de GTPase. A magnitude desse aumento é

diferente para tipos distintos de efetor. Por ser a hidrólise de GTP a etapa

que abole a capacidade da subunidade α de produzir seu efeito, a

regulação de sua atividade de GTPase pela proteína efetora significa que

a ativação do efetor tende a ser autolimitante. Para além disso, existe um

grupo de cerca de 20 proteínas celulares, reguladoras de sinalização da

proteína G (RGS) (revisão de Sjögren, 2017), que apresentam uma

sequência que liga especificamente as subunidades α, de forma a

aumentar significativamente a atividade de GTPase e, dessa forma,

acelerar a hidrólise de GTP e inativar o composto. As proteínas RGS

exercem, assim, efeito inibitório na sinalização de proteína G, um

mecanismo que se acredita ter uma função reguladora em muitas

situações.

As diferentes GPCR acoplam-se a diferentes proteínas G e, assim, produzem

respostas celulares distintas. Por exemplo, os receptores muscarínicos M 2 da

acetilcolina (mAChRs) e β 1 adrenérgicos, ambos os quais ocorrem nas células

musculares cardíacas, produzem efeitos funcionais opostos (ver Capítulos 14

e 15). Quatro classes principais de proteína G (Gs, Gi, Go e Gq) são de

importância farmacológica (Tabela 3.3). Estas diferem principalmente quanto

à subunidade α que elas contêm.13 As proteínas G mostram seletividade no

que diz respeito aos receptores e aos efetores com os quais se acoplam, tendo

domínios de reconhecimento específico em sua estrutura complementar para

domínios de ligação de proteína G específicos nas moléculas receptoras e

efetoras. Por exemplo, a Gs e a Gi produzem, respectivamente, estimulação e

inibição da enzima adenilato ciclase (Figura 3.10).

 

Tabela 3.3 Principais subtipos de proteína G e suas

funções.a

Subtipos Efetores principais Notas

Subunidades Gαb

Ativadas pela toxina do cólera, que

Gα Estimula a adenilato ciclase, aumentando a formação de cAMP bloqueia a atividade GTPase, o que imprede s

a inativação

Bloqueadas por toxina pertussis, que

Gα Inibe a adenilato ciclase, diminuindo a formação de cAMP i

impede a dissociação do complexo αβγ

 

Gαo principalmente às subunidades βγ) ? Efeitos limitados da subunidade α (os efeitos devem-se Bloqueada pela toxina pertussis. Ocorre principalmente no sistema nervoso

Ativa a fosfolipase C, aumentando a produção dos segundos

 

Gαq 2++ liberando assim Ca mensageiros inositol trifosfato e diacilglicerol (pp. 36-38), das reservas intracelulares e ativando a

proteinoquinase C (PKC)

Gα Ativa Rho e, portanto, Rho quinase 12/13

Subunidades Gβγ

Ativam canais de potássio

Inibem canais de cálcio controlados por voltagem

Muitas isoformas de βγ identi cadas, mas

Ativam as GPCR quinases (GRK, pp. 38-39)

as funções especí cas ainda não são

Ativam a cascata de proteinoquinases ativadas por mitógenos conhecidas

Interagem com algumas formas de adenilato ciclase e com

fosfolipase Cβ

aEsta tabela lista apenas as isoformas de maior signi cância farmacológica. Muitas outras foram identi cadas, algumas, inclusive,

têm funções no olfato, paladar, transdução visual e em outras funções siológicas (Offermanns, 2003).

bInicialmente, os índices “s” e “i” foram usados para denotar ações estimulatórias e inibitórias sobre a adenilato ciclase, mas,

subsequentemente, os termos usados, “q” e “12/13”, têm pouca lógica por trás do seu uso.

GPCR, receptor acoplado à proteína G (G-protein-coupled receptor).

 

Figura 3.10 Controle bidirecional de uma enzima-alvo como a adenilato ciclase, por

Gs e Gi. A heterogeneidade das proteínas G permite que receptores diferentes exerçam efeitos opostos em uma mesma enzima-alvo.

 

Uma diferença funcional que se mostrou útil como ferramenta

experimental para distinguir qual tipo de proteína G está envolvido em

diferentes situações diz respeito à ação de duas toxinas bacterianas: a toxina

colérica e a toxina pertussis (ver Tabela 3.3). Essas toxinas, que são enzimas, catalisam uma reação de conjugação (ribosilação do ADP) na subunidade α

das proteínas G. A toxina colérica age somente na Gs e causa ativação persistente. Muitos dos sintomas da cólera, como excreção excessiva de

fluido pelo epitélio gastrintestinal (levando a “fezes de água de arroz”),

devem-se à ativação descontrolada da adenilato ciclase. A toxina pertussis

bloqueia especificamente a Gi e a Go, por impedir a dissociação do trímero da proteína G. A toxina pertussis é liberada da bactéria Bordetella pertussis, que

causa tosse convulsa (coqueluche). Tal como acontece com a toxina da

cólera, os sintomas causados pela toxina pertussis estão relacionados aos seus

efeitos nas proteínas G, mas, neste caso, inibindo G i e Go em vez de ativar Gs, e levando a mudanças na secreção do trato respiratório e a uma tosse distinta,

em vez da diarreia abundante de cólera.

 

Alvos das proteínas G

Os principais alvos das proteínas G, por meio dos quais os GPCR controlam

diferentes aspectos da função celular (Tabela 3.3), são:

 

• Adenilato ciclase, uma enzima responsável pela formação de cAMP

• Fosfolipase C, enzima responsável pela formação de fosfato de inositol e

diacilglicerol (DAG)

• Canais iônicos, particularmente os canais de cálcio e de potássio

• Rho A/Rho quinase, um sistema que regula a atividade das muitas vias de

sinalização que controlam o crescimento, a proliferação e a motilidade

celular, a contração da musculatura lisa etc.

• Proteinoquinase ativada por mitógenos (MAP-quinase), um sistema que

controla muitas funções celulares, incluindo a divisão celular, sendo

também um alvo para vários receptores ligados a quinases.

 

■ Sistema adenilato ciclase/cAMP

A descoberta por Sutherland et al. do papel do cAMP (3’,5’-adenosina-

monofosfato cíclico) como mediador intracelular derrubou, de uma só vez, as

barreiras existentes entre a bioquímica e a farmacologia, introduzindo o

conceito de segundos mensageiros na transdução do sinal. O cAMP é um

nucleotídio sintetizado no interior da célula a partir do ATP, pela ação de uma

enzima ligada à membrana, a adenilato ciclase. É produzido continuamente e

inativado por hidrólise a 5’-AMP, por meio da ação de uma família de

enzimas conhecidas como fosfodiesterases (PDE; do inglês,

phosphodiesterases). Muitos fármacos, hormônios e neurotransmissores

diferentes agem nos GPCR e produzem seus efeitos aumentando ou

diminuindo a atividade catalítica da adenilato ciclase (ver Figura 3.10),

elevando ou diminuindo, assim, a concentração de cAMP dentro da célula.

Nas células dos mamíferos, existem dez isoformas moleculares diferentes da

enzima, algumas das quais respondem seletivamente a Gα s ou Gαi.

AMP cíclico regula muitos aspectos da função celular, incluindo, por

exemplo, enzimas envolvidas no metabolismo energético, divisão e

diferenciação celulares, transporte de íons, canais iônicos e as proteínas

contráteis no músculo liso. Todos esses efeitos variados são, contudo,

efetuados por um mecanismo em comum, ou seja, a ativação de

proteinoquinases por cAMP (conhecida como proteinoquinase dependente de

AMP cíclico) em células eucarióticas. Uma importante proteinoquinase

dependente de AMP cíclico é a proteinoquinase A (PKA). As

proteinoquinases regulam a função de muitas proteínas celulares diferentes

pelo controle da fosforilação proteica. A Figura 3.11 mostra como a produção

aumentada de cAMP em resposta à ativação do β-adrenorreceptor afeta as

enzimas envolvidas no metabolismo do glicogênio e da gordura no fígado e

nas células adiposas e musculares. O resultado é uma resposta coordenada, na

qual a energia armazenada em forma de glicogênio e gordura se torna

disponível em forma de glicose para suprir a contração muscular.

Outros exemplos de regulação pela PKA incluem a atividade aumentada

dos canais de cálcio ativados por voltagem nas células do músculo cardíaco

(ver Capítulo 22). A fosforilação desses canais aumenta a quantidade de Ca2+

que entra na célula durante o potencial de ação e, por conseguinte, aumenta a

força da contração do coração.

No músculo liso, a PKA fosforila (e assim inativa) outra enzima, a

quinase da miosina de cadeia leve, que é necessária à contração. Isso explica

o relaxamento do músculo liso produzido por muitos fármacos que aumentam

a produção de cAMP no músculo liso (ver Capítulo 4).

Como já mencionado, os receptores ligados à Gi, mais do que à Gs, inibem a adenilato ciclase e, assim, reduzem a formação de cAMP para

elucidar respostas opostas aos receptores que ativam Gs. Os exemplos

incluem certos tipos de mAChR (p. ex., o receptor M 2 do músculo cardíaco;

ver Capítulo 14), os α2-adrenorreceptores no músculo liso (ver Capítulo 15) e

os receptores opioides (ver Capítulo 43). A adenilato ciclase pode ser

diretamente ativada por fármacos como o forskolin, que está sendo utilizado

experimentalmente no estudo do papel do sistema cAMP.

O AMP cíclico é hidrolisado dentro das células pelas PDE, uma

importante e ubíqua família de enzimas. Existem 24 subtipos de PDE, dos

quais alguns são mais seletivos para o cAMP, enquanto outros são mais

seletivos para GMPc. A maioria é fracamente inibida por fármacos como

metilxantinas (p. ex., teofilina e cafeína; ver Capítulos 29 e 49). O

roflumilaste (usado no tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica

[DPOC]; ver Capítulo 29) é seletivo para PDE4B, expressa em células inflamatórias; a milrinona (um inotrópico positivo que faz o coração bater

mais forte e, às vezes, é usado para tratamento sintomático em pacientes que

estão aguardando transplante cardíaco; ver Capítulo 22) é seletiva para

PDE2A, que é expressa no músculo cardíaco; a sildenafila (mais conhecida

como Viagra®; ver Capítulo 36) é seletiva para PDE5A e, consequentemente, reforça os efeitos vasodilatadores do óxido nitroso (NO) e de fármacos que

liberam NO, cujos efeitos são mediados por GMPc (ver Capítulo 21). A

similaridade entre algumas ações desses fármacos com as das aminas

simpatomiméticas (ver Capítulo 15) provavelmente reflete sua propriedade

comum, que é a de aumentar a concentração intracelular de cAMP.

 

Figura 3.11 Regulação do metabolismo energético por cAMP. AC, adenilato ciclase.

 

■ Sistema fosfolipase C/fosfato de inositol O sistema fosfoinositídio, um importante sistema intracelular de segundos

mensageiros, foi descoberto nos anos 1950 por Hokin e Hokin, que estavam

interessados principalmente no mecanismo de secreção de sais pelas

glândulas nasais das aves marinhas. Eles constataram que a secreção era

acompanhada de aumento da renovação de uma classe menor de fosfolipídios

de membrana, conhecidos como fosfoinositídios (coletivamente denominados

PI [phosphoinositides]; Figura 3.12). Posteriormente, Michell e Berridge

descobriram que muitos hormônios que produzem elevação na concentração

intracelular de Ca2+ livre (incluindo, por exemplo, agonistas muscarínicos e

agonistas de α-adrenorreceptores que agem no músculo liso e nas glândulas

salivares) também aumentam a renovação de PI. Posteriormente, descobriu-se

que um membro em particular da família PI, chamado fosfatidilinositol (4,5)

bifosfato (PIP 2), que contém grupos adicionais de fosfato ligados ao anel

inositol, desempenha um papel-chave. O PIP2 é o substrato de uma enzima ligada à membrana, a fosfolipase Cβ (PLCβ), que efetua sua clivagem em

DAG e inositol (1,4,5) trifosfato (IP3; Figura 3.13), os quais atuam como segundos mensageiros, conforme discutido mais adiante (p. 36). A ativação

da PLCβ por vários agonistas é mediada por uma proteína G (Gq; ver Tabela

3.3). Após a clivagem do PIP 2, o status quo é restabelecido, como mostra a

Figura 3.13, sendo o DAG fosforilado destinado a formar ácido fosfatídico

(PA), enquanto o IP3 é desfosforilado e, a seguir, reacoplado ao PA, para

formar PIP 2 mais uma vez.14 O lítio, um agente usado em psiquiatria (ver

Capítulo 48), bloqueia essa via de reciclagem (ver Figura 3.13).

Figura 3.12 Estrutura do fosfatidilinositol bifosfato (PIP ), mostrando pontos de 2 clivagem por diferentes fosfolipases para produzir mediadores ativos. A clivagem pela fosfolipase A (PLA ) produz ácido araquidônico. A clivagem pela fosfolipase C (PLC) produz 2 2

inositol trifosfato (I(1, 4, 5)P3) e diacilglicerol (DAG). PA, ácido fosfatídico; PLD, fosfolipase D.

Fosfatos de inositol e cálcio intracelular

O inositol (1,4,5) trifosfato (IP 3) é um mediador hidrossolúvel que é liberado

no citosol e age em um receptor específico – o receptor IP3 –, que é um canal de cálcio controlado por ligante presente na membrana do retículo

endoplasmático (ver Figura 3.5). A função principal do IP3, descrita em mais

detalhes no Capítulo 4, é controlar a liberação de Ca2+ das reservas intracelulares. Como muitos efeitos de fármacos e hormônios envolvem o

Ca2+ intracelular, essa via é particularmente importante.

Diacilglicerol e proteinoquinase C

O DAG é produzido, assim como o IP3, sempre que ocorre hidrólise de PI induzida por receptores. O principal efeito do DAG é ativar uma

proteinoquinase, a proteinoquinase C (PKC), que catalisa a fosforilação de

várias proteínas intracelulares. O DAG, diferentemente dos fosfatos de

inositol, é bastante lipofílico e se mantém na membrana. Liga-se a um ponto

específico na molécula da PKC, fazendo com que a enzima migre do citosol

para a membrana da célula, tornando-se, então, ativada. Existem pelo menos

dez diferentes subtipos de PKC em mamíferos, com distribuições celulares

distintas e que fosforilam diferentes proteínas. Vários são ativados por DAG

e por níveis intracelulares elevados de Ca2+, ambos produzidos pela ativação

de GPCR.15 As PKC são ativadas também por ésteres de forbol (compostos

altamente irritantes produzidos por certas plantas, que promovem a formação

de tumores) que têm sido extremamente úteis no estudo das funções da PKC.

Um dos subtipos é ativado pelo mediador lipídico, o ácido araquidônico (ver

Capítulo 18), produzido pela ação da fosfolipase A2 sobre os fosfolipídios da membrana, de modo que também pode ocorrer a ativação da PKC por

agonistas que ativam aquela enzima. As várias isoformas da PKC, como as

tirosinoquinases, discutidas adiante (p. 40), agem em muitas proteínas

funcionais diferentes, como canais iônicos, receptores, enzimas (incluindo

outras quinases), fatores de transcrição e proteínas do citoesqueleto. A

fosforilação de proteínas pelas quinases desempenha função central na

transdução de sinal, regulando muitos aspectos diferentes da função celular.

A conexão DAG-PKC fornece um mecanismo pelo qual os GPCR podem

mobilizar esse exército de agentes controladores.

 

■ Canais iônicos como alvos das proteínas G

Outra função importante dos GPCR é o controle da função dos canais iônicos

diretamente através de mecanismos que não envolvem segundos mensageiros

como cAMP ou fosfatos de inositol. A interação direta do canal proteína G,

através das subunidades βγ das proteínas G i e Go, aparenta ser um mecanismo geral para controle dos canais K+ e Ca2+. No músculo cardíaco, por exemplo,

é dessa forma que mAChR aumentam a permeabilidade de K+

(hiperpolarizando, portanto, as células e inibindo a atividade elétrica; ver

Capítulo 22). Mecanismos semelhantes operam nos neurônios, em que muitos

fármacos inibitórios, como, por exemplo, os analgésicos opioides, reduzem a

excitabilidade ao abrirem determinados canais K+ – conhecidos como canais

de K+ retificados internamente pela proteína G (GIRK) – ou através da

inibição dos canais N e Ca2+ tipo P/Q dependentes da voltagem, dessa forma,

reduzindo a liberação do neurotransmissor (ver Capítulos 4 e 43).

 

■ Sistema Rho/Rho quinase

▼ Essa via de transdução de sinal (Bishop e Hall, 2000) é ativada por

certos GPCR (e também por mecanismos não GPCR), que se acoplam a

proteínas G do tipo G12/13. A subunidade α livre da proteína G interage

com o fator de troca do nucleotídio guanosina, que facilita a permuta

GDP-GTP em outra GTPase, Rho. A Rho-GDP, que é a forma de

repouso, é inativa, mas, quando ocorre a permuta GDP-GTP, a Rho é

ativada e, por sua vez, ativa a Rho quinase. A Rho quinase fosforila

muitos substratos proteicos e controla uma ampla variedade de funções

celulares, incluindo contração e proliferação do músculo liso, movimento

e migração celulares, angiogênese e remodelação sináptica. Por aumentar

a vasoconstrição da artéria pulmonar induzida por hipoxia, a ativação da

Rho quinase é considerada importante na patogênese da hipertensão

pulmonar (ver Capítulo 23). Inibidores específicos da Rho quinase estão

em desenvolvimento para várias indicações clínicas, incluindo o

glaucoma – uma área a ser observada.

 

■ Sistema das MAP-quinase

▼ O sistema das MAP-quinase envolve várias vias de transdução de sinal

(ver Figura 3.15) que são ativadas, não só por várias citocinas e fatores de

crescimento que atuam nos receptores operados por quinases (p. 41, ver

Figura 3.17), mas também por ligantes de GPCR. A ligação de GPCR a

diferentes grupos de MAP-quinases pode envolver as subunidades α e βγ

da proteína G, bem como Src e arrestinas – proteínas também envolvidas

na dessensibilização do GPCR (p. 38). O sistema da MAP-quinase

controla muitos dos processos envolvidos na expressão genética, na

divisão celular, na apoptose e na regeneração dos tecidos.

Figura 3.13 Ciclo do fosfatidilinositol (PI). A ativação da fosfolipase C mediada por receptor resulta na clivagem do fosfatidilinositol bifosfato (PIP ), formando diacilglicerol 2 (DAG) (que ativa a proteinoquinase C) e inositol trifosfato (IP 2+ 3) (que libera Ca intracelular). Não se sabe ao certo a função do inositol tetrafosfato (IP ), que é formado a partir do IP e 4 3 de outros fosfatos de inositol, mas pode facilitar a entrada de Ca2+ através da membrana plasmática. O IP é inativado por desfosforilação em inositol. O DAG é convertido em ácido 3

 

fosfatídico, e esses dois produtos são usados para regenerar o PI e o PIP . 2

Efetores controlados por proteínas G

 

Duas vias essenciais de segundos mensageiros são controladas por receptores via proteínas G:

• Adenilato ciclase/cAMP:

– Podem ser ativadas ou inibidas por ligantes farmacológicos, dependendo da natureza

do receptor e da proteína G

– A adenilato ciclase catalisa a formação do mensageiro intracelular cAMP

– O cAMP ativa várias proteinoquinases, como a proteinoquinase A (PKA), que controlam

a função celular de muitas maneiras diferentes, por meio de fosforilação de várias

enzimas, transportadores e outras proteínas

• Fosfolipase C/trifosfato de inositol (IP3)/diacilglicerol (DAG):

– Catalisa a formação de dois mensageiros intracelulares, IP3 e DAG, a partir de

fosfolipídios de membrana

– 2+ 2+ O IP atua aumentando o Ca citosólico livre, pela liberação de Ca de compartimentos

3

intracelulares

– 2+ O aumento do Ca livre dá início a vários eventos, incluindo contração, secreção,

ativação de enzimas e hiperpolarização de membranas

– O DAG ativa a proteinoquinase C (PKC), que controla muitas funções celulares mediante

fosforilação de várias proteínas.

As proteínas G ligadas a receptores controlam também:

• Canais iônicos:

– Abertura de canais de potássio que resulta em uma hiperpolarização da membrana

– Inibição de canais de cálcio, reduzindo, assim, a liberação de neurotransmissores

• Fosfolipase A2 (e, portanto, a formação de ácido araquidônico e eicosanoides).

Os principais papéis prováveis dos GPCR no controle das enzimas e dos canais iônicos estão

apresentados de forma resumida na Figura 3.14.

Figura 3.14 Controle dos sistemas efetores celulares pela proteína G e segundos

mensageiros. Estão ausentes nesta figura as vias de sinalização nas quais as arrestinas (e não as proteínas G) se ligam aos receptores acoplados à proteína G para desencadear os

eventos seguintes (downstream) (ver texto e Figura 3.15). AA, ácido araquidônico; DAG, diacilglicerol; IP3, inositol trifosfato.

Figura 3.15 Ativação da cascata proteinoquinase ativada por mitógeno (MAP-

quinase) do receptor acoplado à proteína G (GPCR). A. Ativação sequencial de múltiplos compostos da cascata MAP-quinase. A ativação da cascata MAP-quinase do GPCR pode envolver as subunidades Gα e βγ (não apresentado). B. Ativação do ERK e do JNK3 por meio da interação com as arrestinas (βARR). A ativação do ERK pode acontecer tanto na membrana plasmática envolvendo Src como mediante ativação direta após internalização do complexo receptor/arrestina. ARR, arrestina; GRK, receptor de quinases acopladas à proteína G.

 

Outros desenvolvimentos na biologia do GPCR

▼ No início dos anos 1990, acreditava-se que já se conhecia, em certa

medida, a função do GPCR, tal como descrito anteriormente. Desde

então, o enredo tem apresentado complicações, e desenvolvimentos

posteriores levaram à necessidade de uma revisão substancial do modelo

básico.

 

■ Dessensibilização do GPCR

▼ Tal como descrito no Capítulo 2, a dessensibilização é característica da

maior parte dos GPCR, e os mecanismos subjacentes têm sido estudados

exaustivamente. A dessensibilização homóloga restringe-se aos

receptores ativados pelo agonista dessensibilizador, enquanto a

dessensibilização heteróloga afeta também outros GPCR. Há dois

processos principais envolvidos (Kelly et al., 2008):

• Fosforilação do receptor

• Internalização do receptor (endocitose).

 

A sequência de GPCR inclui determinados resíduos (serina e treonina),

principalmente na extremidade do C-terminal citoplasmático, que pode

sofrer fosforilação por meio de GPCR quinases (GRK) específicas e por

quinases como PKA e PKC.

Na ativação do receptor, GRK2 e GRK3 são recrutados para a membrana

plasmática ao se ligarem a subunidades βγ dispersas da proteína G.

Posteriormente, os GRK fosforilam os receptores em seu estado ativado

(i. e., ligados ao agonista). O receptor fosforilado atua como um local de

ligação das arrestinas, proteínas intracelulares que bloqueiam a interação

do receptor com as proteínas G, produzindo uma dessensibilização

homóloga seletiva. A ligação da arrestina também sinaliza o receptor para

endocitose através de vesículas revestidas por clatrina (Figura 3.16). O

receptor internalizado pode, então, ser desfosforilado e reinserido na

membrana plasmática (ressensibilização) ou encaminhado para os

lisossomos, onde é degradado (inativação). Aparentemente, esse tipo de

dessensibilização ocorre na maioria dos GPCR, mas com diferenças sutis

que fascinam os aficionados.

A fosforilação por PKA e PKC em resíduos diferentes dos visados pelos

GRK conduz normalmente a uma ligação fraca entre o receptor ativo e a

proteína G, e, por essa razão, o efeito do agonista é reduzido. Isso pode

conduzir a uma dessensibilização homóloga ou heteróloga, dependendo

de outros receptores, que não aqueles envolvidos com o agonista

dessensibilizado, serem simultaneamente desfosforilados pelas quinases,

algumas, inclusive, não muito seletivas. Provavelmente, os receptores

fosforilados pelas quinases dos segundos mensageiros não são

internalizados e são reativados pela fosforilação por meio de fosfatases

quando o agonista é removido.

Figura 3.16 Dessensibilização e movimentação dos receptores acoplados à proteína

G (GPCR). Na ativação prolongada do agonista do GPCR, determinados GPCR de quinases (GRK) são recrutados para a membrana plasmática e fosforilam o receptor. A essa altura, a arrestina (ARR) liga e desloca o GPCR para vesículas revestidas de clatrina para uma subsequente internalização nos endossomas, em um processo dependente de dinamina. O GPCR, então, é desfosforilado por uma fosfatase (PP2A) ou é reenviado para a membrana plasmática, ou ainda é degradado pelos lisossomos. Dyn, dinamina; GRK, receptor de quinases acoplados à proteína G; PP2A, fosfatase 2A.

 

■ Oligomerização do GPCR

▼ A visão convencional de que GPCR existem e funcionam como

proteínas monoméricas (em contraste com os canais iônicos, que, em

geral, formam complexos multiméricos; p. 28) foi abalada pelo trabalho

realizado com o receptor GABA . Existem dois subtipos desse GPCR, B

codificados por genes diferentes, e o receptor funcional consiste em um

heterodímero de ambos (ver Capítulo 39). Uma situação semelhante

ocorre com os receptores de glutamato acoplados à proteína G.

Curiosamente, embora o dímero GABAB contenha dois locais potenciais

de ligação a agonistas – um em cada subunidade –, apenas um é

funcional, e a sinalização é feita por meio do dímero para o outro receptor

no dímero acoplado à proteína G (Figura 39.9).

Outros GPCR são funcionais como monômeros. Agora, parece provável

que a maioria, se não todos os GPCR, possa existir como oligômeros

homéricos ou heteroméricos (i. e., dímeros ou grandes oligômeros) (Ferré

et al., 2015). No grupo dos receptores opioides (ver Capítulo 43), o

receptor foi cristalizado como dímero, e heterodímeros estáveis e

funcionais dos receptores e δ, cujas propriedades farmacológicas são

distintas daquelas apresentadas por qualquer das moléculas originárias,

foram criados em linhagens celulares. Também se descobriu maior

diversidade de combinações do GPCR, como, por exemplo, entre

receptores de dopamina (D2) e somatostatina, nos quais ambos os ligantes

agem com potência aumentada. Divagando um pouco mais no campo da

pesquisa de atribuições funcionais, o receptor de dopamina D5 pode

acoplar-se diretamente a um canal iônico controlado por ligante, o

receptor de GABA A, inibindo a função deste último sem a intervenção de

nenhuma proteína G (Liu et al., 2000). Até agora, essas interações foram

estudadas principalmente em linhagens celulares desenvolvidas por

engenharia genética, mas também ocorrem em células nativas.

Complexos diméricos funcionais entre receptores de angiotensina (AT 1) e

bradicinina (B 2) ocorrem em plaquetas humanas e mostram maior

sensibilidade à angiotensina do que a receptores de AT1 “puros” (AbdAlla

et al., 2001). Em mulheres com hipertensão relacionada com a gravidez

(toxemia pré-eclâmptica), o número desses dímeros aumenta devido à

expressão aumentada de receptores B2, resultando – paradoxalmente – em

aumento de sensibilidade à ação vasoconstritora da angiotensina.

É muito cedo para dizer qual impacto essa versatilidade recém-descoberta

dos GPCR em se conectar com outros receptores para formar

combinações funcionais terá na farmacologia convencional e na

terapêutica, mas pode ser considerável.

 

■ Receptores constitutivamente ativos

▼ Os GPCR podem estar ativos constitutivamente (i. e.,

espontaneamente) na ausência de qualquer agonista (ver Capítulo 2 e

revisão por Costa e Cotecchia, 2005). Isso foi inicialmente demonstrado

em receptores δ opioides (ver Capítulo 43). Atualmente, existem muitos

outros exemplos de GPCR nativos que mostram atividade constitutiva

quando estudados in vitro. O receptor de histamina H3 também mostra

atividade constitutiva in vivo, e isso pode ser um fenômeno muito geral.

Isso significa que os agonistas inversos (ver Capítulo 2), que suprimem

essa atividade basal, podem exercer efeitos distintos aos dos agonistas

neutros, que bloqueiam os efeitos do agonista sem afetar a atividade

basal.

 

■ Especificidade do agonista

▼ Acreditava-se que a conexão entre determinado GPCR e uma via de

transdução de sinal dependesse principalmente da estrutura do receptor,

que confere especificidade a certa proteína G, a partir da qual o restante

da via de transdução de sinal prossegue. Isso significaria que, consoante o

modelo de dois estados, discutido no Capítulo 2, todos os agonistas com

ação em um receptor em particular estabilizariam o mesmo estado ativado

(R*) e deveriam ativar a mesma via de transdução de sinal, produzindo o

mesmo tipo de resposta celular. Atualmente está claro que essa visão é

uma supersimplificação. Em muitos casos, por exemplo, com agonistas

que agem em receptores da angiotensina, ou agonistas inversos no β-

adrenorreceptor, os efeitos celulares são qualitativamente distintos com

diferentes ligantes, levando a crer na existência de mais de um –

provavelmente muitos – estados R* (por vezes, referido como agonismo

tendencioso; ver Capítulo 2). A ligação das arrestinas aos GPCR inicia o

processo de sinalização da MAP-quinase, de modo que os agonistas que

induzem a “dessensibilização” GRK/arrestina vão terminar parte da

sinalização GPCR, mas também poderão ativar a sinalização por meio das

arrestinas, o que pode continuar mesmo depois de o composto

receptor/arrestina ter sido internalizado (ver Figura 3.15).

O agonismo tendencioso tem implicações profundas – o que até constitui

uma heresia para alguns farmacologistas que estão acostumados a refletir

sobre os agonistas em termos de sua afinidade e eficácia e nada mais;

esses fatos abriram uma nova dimensão na maneira de entender a eficácia

e a especificidade dos fármacos (Kenakin e Christopoulos, 2013).

 

■ Proteínas modificadoras da atividade dos receptores

▼ As proteínas modificadoras da atividade dos receptores (RAMP; do

inglês, receptor activity-modifying proteins) constituem uma família de

proteínas de membrana que se associam a vários GPCR e alteram suas

características funcionais. Foram descobertas em 1998, quando se

verificou que o receptor funcionalmente ativo de um neuropeptídio, o

peptídio relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) (ver Capítulos

16 e 19), consiste em um complexo formado por um GPCR – chamado

receptor semelhante ao receptor de calcitonina (CRLR; do inglês,

calcitonin receptor-like receptor) – que, por si, não apresenta atividade, e

outra proteína de membrana (RAMP1). Surpreendentemente, o CRLR,

quando acoplado a outra RAMP (RAMP2), demonstrou uma

farmacologia bem diferente, sendo ativado por outro peptídio, a

adrenomedulina. Em outras palavras, a especificidade ao agonista é

conferida pela RAMP associada, assim como pelo próprio GPCR.

Surgiram mais RAMP e, até o presente, quase todos os exemplos

implicam receptores peptídicos da classe B (ver Tabela 3.2), exceto no

caso do receptor sensível ao cálcio. As RAMP são um exemplo de como

as interações proteína-proteína influenciam o comportamento

farmacológico dos receptores de forma altamente seletiva, podendo

tornar-se novos alvos no desenvolvimento de fármacos (Sexton et al.,

2012).

 

■ Sinalização independente das proteínas G

▼ Ao usarmos a expressão receptores acoplados à proteína G para

descrever a classe de receptores caracterizada por sua estrutura hepta-

helicoidal, estamos seguindo dogmas de textos convencionais, mas

negligenciando o fato de que as proteínas G não são o único vínculo entre

GPCR e os vários sistemas efetores que regulam. Nesse contexto, é

importante a sinalização mediada por arrestinas ligadas ao receptor (p.

36), e não por proteínas G (revisão de Pierce e Lefkowitz, 2001; Delcourt

et al., 2007). As arrestinas podem agir como intermediários na ativação

do GPCR da cascata de MAP-quinase (ver Figura 3.15B).

Há muitos exemplos em que as várias “proteínas adaptadoras”, que ligam

os receptores do tipo tirosinoquinase a seus efetores (p. 42), também

podem interagir com os GPCR (Brzostowski e Kimmel, 2001),

permitindo que os mesmos sistemas efetores possam ser regulados por

receptores de ambos os tipos.

 

Em resumo, o simples dogma que sustentou muito do nosso conhecimento

sobre os GPCR, como um gene GPCR – uma proteína GPCR – um GPCR funcional – uma proteína G – uma resposta está dando sinais de mudança. Em